जैवप्रौद्योगिकी उन तकनीकों से संबंधित है जो मानवों के लिए उपयोगी उत्पादों और प्रक्रियाओं को बनाने के लिए जीवित जीवों या जीवों से प्राप्त एंजाइमों का उपयोग करती हैं। इस अर्थ में, दही, ब्रेड या वाइन बनाना, जो सभी सूक्ष्मजीव-माध्यित प्रक्रियाएँ हैं, को भी जैवप्रौद्योगिकी का एक रूप माना जा सकता है। हालाँकि, आज इसका प्रयोग एक सीमित अर्थ में किया जाता है, उन प्रक्रियाओं के लिए जो आनुवंशिक रूप से संशोधित जीवों का उपयोग बड़े पैमाने पर यही कार्य सिद्ध करने के लिए करती हैं। इसके अतिरिक्त, कई अन्य प्रक्रियाओं/तकनीकों को भी जैवप्रौद्योगिकी के अंतर्गत शामिल किया गया है। उदाहरण के लिए, इन विट्रो निषेचन जिससे ‘टेस्ट-ट्यूब’ बच्चा पैदा होता है, एक जीन संश्लेषित करना और उसका उपयोग करना, एक डीएनए वैक्सीन विकसित करना या एक दोषपूर्ण जीन को सुधारना, सभी जैवप्रौद्योगिकी का हिस्सा हैं।

यूरोपीय जैवप्रौद्योगिकी महासंघ (EFB) ने जैवप्रौद्योगिकी की एक ऐसी परिभाषा दी है जो पारंपरिक दृष्टिकोण और आधुनिक आणविक जैवप्रौद्योगिकी दोनों को समाहित करती है। EFB द्वारा दी गई परिभाषा इस प्रकार है: ‘प्राकृतिक विज्ञान और जीवों, कोशिकाओं, उनके अंशों और अणु समानालियों का उत्पादों और सेवाओं के लिए समेकन’।

11.1 जैवप्रौद्योगिकी के सिद्धांत

कई में से, वे दो मूल तकनीकें जिन्होंने आधुनिक जैवप्रौद्योगिकी के जन्म को संभव बनाया, ये हैं:

(i) आनुवंशिक अभियांत्रिकी : आनुवंशिक पदार्थ (DNA और RNA) की रसायनिक संरचना को बदलने की तकनीकें, इन्हें होस्ट जीवों में पेश करना और इस प्रकार होस्ट जीव की फ़ीनोटाइप को बदलना।

(ii) जैवप्रक्रम अभियांत्रिकी : रासायनिक अभियांत्रिकी प्रक्रियाओं में निर्जीव (सूक्ष्मजीव-रहित) वातावरण बनाए रखना ताकि केवल वांछित सूक्ष्मजीव/यूकैरियोटिक कोशिका का बड़े पैमाने पर विकास हो सके और जैवप्रौद्योगिकी उत्पादों—जैसे प्रतिजैविक, टीके, एंजाइम आदि—का उत्पादन संभव हो सके।

आइए अब जीन अभियांत्रिकी के सिद्धांतों की वैचारिक उत्पत्ति को समझें। आपने सम्भवतः लैंगिक प्रजनन की अलैंगिक प्रजनन पर बढ़त को पहचाना होगा। पहला विविधताओं के अवसर तथा जीन समुच्चय के अद्वितीय संयोजनों के निर्माण की सुविधा देता है, जिनमें से कुछ जीव तथा समष्टि दोनों के लिए लाभकारी हो सकते हैं। अलैंगिक प्रजनन जीन सूचना को संरक्षित करता है, जबकि लैंगिक प्रजनन विविधता की अनुमति देता है। पारंपरिक संकरण प्रक्रियाएँ—जो पादप तथा पशु प्रजनन में प्रयुक्त होती हैं—अक्सर अवांछित जीनों को भी वांछित जीनों के साथ सम्मिलित तथा गुणित कर देती हैं। जीन अभियांत्रिकी की तकनीकें—जिनमें पुनःसंयोजी डीएनए का निर्माण, जीन क्लोनिंग तथा जीन स्थानांतरण शामिल हैं—इस सीमा को पार करती हैं और हमें केवल एक या एक समूह वांछित जीनों को लक्ष्य जीव में प्रवेशित करने की अनुमति देती हैं, बिना अवांछित जीनों को भीतर लाए।

क्या आप जानते हैं कि किसी विदेशी जीव में किसी तरह स्थानांतरित हुए डीएनए के टुकड़े का संभावित भविष्य क्या होता है? सबसे अधिक संभावना है कि यह डीएनए का टुकड़ा जीव की संतति कोशिकाओं में स्वयं को प्रतिकृत करने में असमर्थ होगा। परंतु जब यह ग्राही के जीनोम में समाकलित हो जाता है, तो यह प्रतिकृत हो सकता है और मेज़बान डीएनए के साथ वंशानुगत हो सकता है। ऐसा इसलिए है क्योंकि विदेशी डीएनए का टुकड़ा एक गुणसूत्र का भाग बन गया है, जिसमें प्रतिकृतन करने की क्षमता होती है। एक गुणसूत्र में एक विशिष्ट डीएनए अनुक्रम होता है जिसे प्रतिकृतन का उद्गम कहा जाता है, जो प्रतिकृतन प्रारंभ करने के लिए उत्तरदायी होता है। इसलिए, किसी जीव में किसी विदेशी डीएनए के टुकड़े की प्रतिकृति के लिए आवश्यक है कि वह उन गुणसूत्रों का भाग बने जिनमें ‘प्रतिकृतन का उद्गम’ नामक विशिष्ट अनुक्रम हो। इस प्रकार, एक विदेशी डीएनए को प्रतिकृतन के उद्गम से जोड़ा जाता है, ताकि यह विदेशी डीएनए का टुकड़ा मेज़बान जीव में प्रतिकृत हो सके और स्वयं को गुणा कर सके। इसे क्लोनिंग या किसी टेम्पलेट डीएनए की अनेक समरूप प्रतियाँ बनाना भी कहा जा सकता है।

अब आइए पहली बार किसी कृत्रिम पुनर्संयोजी डीएनए अणु के निर्माण पर ध्यान दें। पहले पुनर्संयोजी डीएनए का निर्माण इस संभावना से उभरा कि एक जीन जो प्रतिजैविक प्रतिरोध को कूटबद्ध करता है, उसे साल्मोनेला टाइफीम्यूरियम के मूल प्लाज्मिड (स्वतः प्रतिकृतिकारी वृत्ताकार गुणसूत्र-बाह्य डीएनए) से जोड़ा जा सके। स्टैनली कोहेन और हर्बर्ट बॉयर ने 1972 में यह कार्य इस प्रकार किया कि उन्होंने एक प्लाज्मिड से प्रतिजैविक प्रतिरोध देने वाले डीएनए के टुकड़े को काटकर प्रतिजैविक प्रतिरोध जीन को पृथक किया। डीएनए को विशिष्ट स्थानों पर काटना तथाकथित ‘आणविक कैंची’– प्रतिबंधन एंजाइमों की खोज से संभव हुआ। काटे गए डीएनए टुकड़े को फिर प्लाज्मिड डीएनए से जोड़ा गया। ये प्लाज्मिड डीएनए उस डीएनए टुकड़े को स्थानांतरित करने के लिए वेक्टर के रूप में कार्य करते हैं जो उससे जुड़ा होता है। आप शायद जानते हैं कि मच्छर मलेरिया परजीवी को मानव शरीर में स्थानांतरित करने वाला कीट वेक्टर है। उसी प्रकार, एक प्लाज्मिड को वेक्टर के रूप में प्रयोग कर किसी विदेशी डीएनए टुकड़े को मेजबान जीव में पहुँचाया जा सकता है। प्रतिजैविक प्रतिरोध जीन को प्लाज्मिड वेक्टर से जोड़ना डीएनए लाइगेज नामक एंजाइम से संभव हुआ, जो कटे हुए डीएनए अणुओं पर कार्य करता है और उनके सिरों को जोड़ता है। इससे एक नया संयोजन वृत्ताकार स्वतः प्रतिकृतिकारी डीएनए इन विट्रो में बनता है जिसे पुनर्संयोजी डीएनए कहा जाता है। जब इस डीएनए को एस्चेरिचिया कोलाई में स्थानांतरित किया गया, जो साल्मोनेला से निकट संबंधित एक जीवाणु है, तो यह नए मेजबान के डीएनए पॉलिमरेज़ एंजाइम का उपयोग कर प्रतिकृतियाँ बना सका। ई. कोलाई में प्रतिजैविक प्रतिरोध जीन की प्रतियों को बढ़ाने की इस क्षमता को ई. कोलाई में प्रतिजैविक प्रतिरोध जीन का क्लोनिंग कहा गया।

इससे आप निष्कर्ष निकाल सकते हैं कि किसी जीव को जेनेटिकली संशोधित करने में तीन मूलभूत चरण होते हैं —

(i) वांछनीय जीनों वाले डीएनए की पहचान;

(ii) पहचाने गए डीएनए को मेज़बान में प्रवेश कराना;

(iii) मेज़बान में प्रवेश कराए गए डीएनए को बनाए रखना और उस डीएनए को उसकी संतानों में स्थानांतरित करना।

11.2 पुनःसंयोजक डीएनए प्रौद्योगिकी के उपकरण

अब हम उपरोक्त चर्चा से जान चुके हैं कि जेनेटिक इंजीनियरिंग या पुनःसंयोजक डीएनए प्रौद्योगिकी तभी संभव है जब हमारे पास प्रमुख उपकरण हों, अर्थात् प्रतिबंध एंजाइम, पॉलिमरेज़ एंजाइम, लाइगेस, वेक्टर और मेज़बान जीव। आइए इनमें से कुछ को विस्तार से समझने का प्रयास करें।

11.2.1 प्रतिबंध एंजाइम

वर्ष 1963 में, एशेरिखिया कोलाई में बैक्टीरियोफेज की वृद्धि को प्रतिबंधित करने वाले दो एंजाइमों को पृथक किया गया। इनमें से एक डीएनए में मेथिल समूह जोड़ता था, जबकि दूसरा डीएनए को काटता था। बाद वाले को प्रतिबंध एंडोन्यूक्लिएस कहा गया।

पहला प्रतिबंध एंडोन्यूक्लिएस–Hind II, जिसका कार्य विशिष्ट डीएनए न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम पर निर्भर करता था, को पाँच वर्ष बाद पृथक और वर्णित किया गया। यह पाया गया कि Hind II हमेशा डीएनए अणुओं को एक विशिष्ट बिंदु पर काटता है जिससे यह छः बेस युग्मों के एक विशिष्ट अनुक्रम को पहचानता है। इस विशिष्ट बेस अनुक्रम को Hind II का पहचान अनुक्रम कहा जाता है। Hind II के अतिरिक्त, आज हम 900 से अधिक प्रतिबंध एंजाइमों को जानते हैं जिन्हें 230 से अधिक जीवाणु उपभेदों से पृथक किया गया है और प्रत्येक भिन्न-भिन्न पहचान अनुक्रमों को पहचानता है।

इन एंजाइमों के नामकरण की परंपरा यह है कि नाम का पहला अक्षर जीनस से आता है और दो अक्षर प्रोकैरियोटिक कोशिका की प्रजाति से आते हैं जिससे उन्हें अलग किया गया था, उदाहरण के लिए, EcoRI Escherichia coli RY 13 से आया है। EcoRI में, अक्षर ‘R’ उपभेद के नाम से लिया गया है। नामों के बाद आने वाली रोमन संख्याएं यह दर्शाती हैं कि उस बैक्टीरिया के उपभेद से एंजाइमों को किस क्रम में अलग किया गया था।

प्रतिबंधन एंजाइम न्यूक्लिएसेज़ नामक एंजाइमों की एक बड़ी श्रेणी से संबंधित होते हैं। ये दो प्रकार के होते हैं; एक्सोन्यूक्लिएसेज़ और एंडोन्यूक्लिएसेज़। एक्सोन्यूक्लिएसेज़ DNA के सिरों से न्यूक्लियोटाइड्स को हटाते हैं जबकि एंडोन्यूक्लिएसेज़ DNA के भीतर विशिष्ट स्थानों पर कट लगाते हैं।

प्रत्येक प्रतिबंधन एंडोन्यूक्लिएसेज़ DNA अनुक्रम की लंबाई की ‘जांच’ करके कार्य करता है। एक बार यह अपना विशिष्ट पहचान अनुक्रम ढूंढ लेता है, यह DNA से बंधेगा और डबल हेलिक्स की दोनों स्ट्रैंडों को उनके शर्करा-फॉस्फेट बैकबोन में विशिष्ट बिंदुओं पर काटेगा (चित्र 11.1)। प्रत्येक प्रतिबंधन एंडोन्यूक्लिएसेज़ DNA में एक विशिष्ट पैलिंड्रोमिक न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम को पहचानता है।

चित्र 11.1 प्रतिबंधन एंडोन्यूक्लिएसेज़ एंजाइम - EcoRI की क्रिया द्वारा पुनः संयोजी DNA के निर्माण के चरण

क्या आप जानते हैं कि पैलिन्ड्रोम क्या होते हैं? ये अक्षरों के ऐसे समूह होते हैं जिन्हें आगे और पीछे दोनों दिशाओं में पढ़ने पर एक ही शब्द बनता है, जैसे “MALAYALAM”। जहाँ एक शब्द-पैलिन्ड्रोम में एक ही शब्द दोनों दिशाओं में पढ़ा जाता है, वहीं DNA में पैलिन्ड्रोम आधार-युग्मों (base pairs) का एक ऐसा क्रम होता है जो दोनों स्ट्रैंड्स पर समान रूप से पढ़ा जाता है जब पढ़ने की दिशा को समान रखा जाता है। उदाहरण के लिए, निम्नलिखित क्रम 5’ $\rightarrow$ 3’ दिशा में दोनों स्ट्रैंड्स पर समान रूप से पढ़ा जाता है। यह 3’ $\rightarrow$ 5’ दिशा में पढ़े जाने पर भी सत्य है।

$ \begin{aligned} 5^{\prime}—– \text { GAATTC }—– 3^{\prime} \\ 3^{\prime}—–\text { CTTAAG }—–5^{\prime} \end{aligned} $

प्रतिबंधक एंजाइम (Restriction enzymes) DNA के स्ट्रैंड को पैलिन्ड्रोम स्थलों के केंद्र से थोड़ी दूरी पर काटते हैं, लेकिन विपरीत स्ट्रैंडों पर समान दो आधारों के बीच। इससे सिरों पर एकल स्ट्रैंड वाले भाग छूट जाते हैं। प्रत्येक स्ट्रैंड पर लटकते हुए हिस्से होते हैं जिन्हें स्टिकी सिरे (sticky ends) कहा जाता है (चित्र 11.1)। इन्हें इसलिए ऐसा नाम दिया गया है क्योंकि ये अपने पूरक कटे हुए समकक्षों के साथ हाइड्रोजन बंध बनाते हैं। सिरों की यह चिपचिपाहट एंजाइम DNA लाइगेस की क्रिया को सुविधाजनक बनाती है।

प्रतिबंधक एंडोन्यूक्लिएसेज़ (Restriction endonucleases) जेनेटिक इंजीनियरिंग में DNA के ‘पुनर्संयोजी’ अणुओं को बनाने के लिए उपयोग किए जाते हैं, जो विभिन्न स्रोतों/जीनोमों से प्राप्त DNA से बने होते हैं।

जब एक ही प्रतिबंधक एंजाइम द्वारा काटा जाता है, तो परिणामी DNA खंडों में समान प्रकार के ‘स्टिकी-सिरे’ होते हैं, और इन्हें DNA लाइगेस का उपयोग करके (सिरे-सिरे से) आपस में जोड़ा जा सकता है (चित्र 11.2)।

आकृति 11.2 पुनः संयोजक डीएनए प्रौद्योगिकी का आरेखीय चित्रण

आपने महसूस किया होगा कि सामान्यतः, जब तक वेक्टर और स्रोत डीएनए को एक ही प्रतिबंधन एंजाइम से नहीं काटा जाता, पुनः संयोजक वेक्टर अणु नहीं बनाया जा सकता।

डीएनए खंडों का पृथक्करण और पृथकीकरण : प्रतिबंधन एंडोन्यूक्लिएसेज़ द्वारा डीएनए के काटने से डीएनए के खंड प्राप्त होते हैं। इन खंडों को जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस नामक तकनीक द्वारा पृथक किया जा सकता है। चूँकि डीएनए खंड ऋणात्मक आवेशित अणु होते हैं, उन्हें एक विद्युत क्षेत्र के अंतर्गत एक माध्यम/मैट्रिक्स के माध्यम से ऐनोड की ओर बढ़ने के लिए मजबूर करके पृथक किया जा सकता है। आजकल सबसे अधिक प्रयुक्त मैट्रिक्स एगारोज है जो समुद्री शैवालों से निकाला गया एक प्राकृतिक बहुलक है। डीएनए खंड अपने आकार के अनुसार एगारोज जेल द्वारा प्रदत्त छनन प्रभाव के माध्यम से पृथक (विभाजित) होते हैं। इसलिए, जितना छोटा खंड का आकार होगा, वह उतना अधिक दूर तक चलेगा। आकृति 11.3 को देखें और अनुमान लगाएँ कि जेल के किस सिरे पर नमूना लोड किया गया था।

आकृति 11.3 एक विशिष्ट एगारोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस जो अपचयित (लेन 1) और पचयित डीएनए खंडों के समूह (लेन 2 से 4) के प्रवासन को दर्शाता है

पृथक किए गए डीएनए अंशों को केवल तभी देखा जा सकता है जब डीएनए को एथिडियम ब्रोमाइड नामक यौगिक से रंगा जाए और फिर यूवी विकिरण के संपर्क में लाया जाए (आप शुद्ध डीएनए अंशों को दृश्य प्रकाश में और बिना रंगे देख नहीं सकते)। आप यूवी प्रकाश के संपर्क में आए एथिडियम ब्रोमाइड से रंगे जेल में डीएनए की चमकीले नारंगी रंग की पट्टियाँ देख सकते हैं (चित्र 11.3)। डीएनए की पृथक की गई पट्टियों को एगारोज जेल से काटा जाता है और जेल के टुकड़े से निकाला जाता है। इस चरण को निष्कासन कहा जाता है। इस प्रकार शुद्ध किए गए डीएनए अंशों का उपयोग क्लोनिंग वेक्टरों के साथ जोड़कर पुनः संयोजक डीएनए बनाने में किया जाता है।

11.2.2 क्लोनिंग वेक्टर

आप जानते हैं कि प्लाज्मिड और बैक्टीरियोफेज में बैक्टीरियल कोशिकाओं के भीतर गुणसूत्रीय डीएनए के नियंत्रण से स्वतंत्र रूप से प्रतिकृत होने की क्षमता होती है। बैक्टीरियोफेज, प्रति कोशिका उनकी उच्च संख्या के कारण, बैक्टीरियल कोशिकाओं के भीतर अपने जीनोम की बहुत उच्च प्रतिलिपि संख्या रखते हैं। कुछ प्लाज्मिडों में प्रति कोशिका केवल एक या दो प्रतिलिपियाँ हो सकती हैं जबकि अन्य में 15-100 प्रतिलिपियाँ हो सकती हैं। उनकी संख्या और भी अधिक हो सकती है। यदि हम किसी विदेशी डीएनए अंश को बैक्टीरियोफेज या प्लाज्मिड डीएनए से जोड़ने में सक्षम होते हैं, तो हम उसकी संख्या को प्लाज्मिड या बैक्टीरियोफेज की प्रतिलिपि संख्या के बराबर गुणा कर सकते हैं। वर्तमान में प्रयुक्त वेक्टर इस प्रकार इंजीनियर किए गए हैं कि वे विदेशी डीएनए को आसानी से जोड़ने और पुनः संयोजकों को गैर-पुनः संयोजकों से चुनने में सहायता करते हैं।

निम्नलिखित वे विशेषताएँ हैं जो किसी वेक्टर में क्लोनिंग को सुगम बनाने के लिए आवश्यक होती हैं।

(i) रेप्लिकेशन का उद्गम (ori) : यह वह अनुक्रम है जहाँ से प्रतिकृतिकरण प्रारंभ होता है और कोई भी DNA खंड जब इस अनुक्रम से जुड़ा जाता है तो वह मेज़बान कोशिकाओं के भीतर प्रतिकृतिकृत हो सकता है। यह अनुक्रम जुड़े हुए DNA की प्रति संख्या को नियंत्रित करने के लिए भी उत्तरदायी होता है। इसलिए, यदि किसी को लक्ष्य DNA की अनेक प्रतियाँ प्राप्त करनी हों तो उसे एक ऐसे वेक्टर में क्लोन करना चाहिए जिसका उद्गम उच्च प्रति संख्या का समर्थन करता हो।

(ii) चयन योग्य चिह्न : ‘ori’ के अतिरिक्त, वेक्टर को एक चयन योग्य चिह्न की आवश्यकता होती है, जो गैर-रूपांतरितों की पहचान और समाप्ति में तथा रूपांतरितों की वृद्धि को चयनपूर्वक अनुमति देने में सहायक होता है। रूपांतरण एक प्रक्रिया है जिसके द्वारा DNA का एक खंड मेज़बान जीवाणु में प्रस्तुत किया जाता है (आप इस प्रक्रिया को आगामी खंड में पढ़ेंगे)। सामान्यतः, ऐसे जीन जो ऐम्पीसिलिन, क्लोरैम्फ़ेनिकॉल, टेट्रासाइक्लिन या कैनामाइसिन आदि प्रतिजैविकों के प्रति प्रतिरोध को संकेतित करते हैं, E. coli के लिए उपयोगी चयन योग्य चिह्न माने जाते हैं। सामान्य E. coli कोशिकाएँ इनमें से किसी भी प्रतिजैविक के विरुद्ध प्रतिरोध नहीं रखती हैं।

आकृति 11.4 E. coli क्लोनिंग वेक्टर pBR322 जिसमें प्रतिबंधन स्थल (Hind III, EcoR I, BamH I, Sal I, Pvu II, Pst I, Cla I), ori और प्रतिजैविक प्रतिरोध जीन (ampR और tetR) दिखाए गए हैं। rop प्लाज़्मिड की प्रतिकृतिकरण में संलग्न प्रोटीनों के लिए संकेतित करता है।

(iii) क्लोनिंग स्थल: विदेशी DNA को जोड़ने के लिए वेक्टर में बहुत कम, अधिकतम एक, सामान्यतः प्रयुक्त प्रतिबंधन एंजाइमों के लिए पहचान स्थल होने चाहिए। वेक्टर में एक से अधिक पहचान स्थलों की उपस्थिति कई खंड उत्पन्न करेगी, जो जीन क्लोनिंग को जटिल बना देगी (चित्र 11.4)। विदेशी DNA का लिगेशन दो एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीनों में से एक में उपस्थित प्रतिबंधन स्थल पर किया जाता है। उदाहरण के लिए, आप वेक्टर pBR322 के टेट्रासाइक्लिन प्रतिरोध जीन के BamH I स्थल पर विदेशी DNA लिगेट कर सकते हैं। पुनः संयोजक प्लाज्मिड विदेशी DNA के समावेश के कारण टेट्रासाइक्लिन प्रतिरोध खो देंगे, लेकिन इन्हें ट्रांसफॉर्मेंट्स को टेट्रासाइक्लिन युक्त माध्यम पर प्लेट करके गैर-पुनः संयोजकों से अलग किया जा सकता है। एम्पीसिलिन युक्त माध्यम पर बढ़ने वाले ट्रांसफॉर्मेंट्स को फिर टेट्रासाइक्लिन युक्त माध्यम पर स्थानांतरित किया जाता है। पुनः संयोजक एम्पीसिलिन युक्त माध्यम पर बढ़ेंगे लेकिन टेट्रासाइक्लिन युक्त माध्यम पर नहीं। परंतु, गैर-पुनः संयोजक दोनों एंटीबायोटिक्स युक्त माध्यम पर बढ़ेंगे। इस स्थिति में, एक एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन ट्रांसफॉर्मेंट्स के चयन में सहायता करता है, जबकि दूसरा एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन विदेशी DNA के समावेश के कारण ‘समावेश के कारण निष्क्रिय’ हो जाता है और पुनः संयोजकों के चयन में सहायता करता है। एंटीबायोटिक्स के निष्क्रिय होने के कारण पुनः संयोजकों का चयन एक कठिन प्रक्रिया है क्योंकि इसके लिए दो भिन्न एंटीबायोटिक्स वाली प्लेटों पर एक साथ प्लेटिंग की आवश्यकता होती है। इसलिए, वैकल्पिक चयनात्मक मार्कर विकसित किए गए हैं जो क्रोमोजेनिक सब्सट्रेट की उपस्थिति में रंग उत्पन्न करने की क्षमता के आधार पर पुनः संयोजकों को गैर-पुनः संयोजकों से अलग करते हैं। इसमें, एक पुनः संयोजक DNA को एक एंजाइम, β-galactosidase, की कोडिंग अनुक्रम के भीतर सम्मिलित किया जाता है। इससे इस एंजाइम के संश्लेषण के लिए जीन निष्क्रिय हो जाता है, जिसे समावेशी निष्क्रियन कहा जाता है। क्रोमोजेनिक सब्सट्रेट की उपस्थिति में नीले रंग के कॉलोनी बनते हैं यदि बैक्टीरिया में प्लाज्मिड में कोई सम्मिलन नहीं है। सम्मिलन की उपस्थिति β-galactosidase जीन के समावेशी निष्क्रियन का परिणाम है और कॉलोनी कोई रंग नहीं उत्पन्न करते, इन्हें पुनः संयोजक कॉलोनी के रूप में पहचाना जाता है।

(iv) पौधों और जानवरों में जीन क्लोन करने के लिए सदिश : आपको आश्चर्य हो सकता है कि हमने पौधों और जानवरों में जीन स्थानांतरित करना जो सीखा है, वह बैक्टीरिया और वायरस से सीखा है जो यह बात सदियों से जानते हैं — यूकैरियोटिक कोशिकाओं में जीन पहुँचाकर उन्हें बदलना और उन्हें वह काम करने के लिए मजबूर करना जो बैक्टीरिया या वायरस चाहते हैं। उदाहरण के लिए, Agrobacterium tumifaciens, जो कई द्विबीजपत्री पौधों का रोगजनक है, एक ऐसा DNA टुकड़ा पहुँचाने में सक्षम है जिसे ‘T-DNA’ कहा जाता है, जो सामान्य पौधे की कोशिकाओं को ट्यूमर में बदल देता है और इन ट्यूमर कोशिकाओं को रोगजनक द्वारा आवश्यक रसायन बनाने के लिए निर्देशित करता है। इसी तरह, जानवरों में रेट्रोवायरस सामान्य कोशिकाओं को कैंसर कोशिकाओं में बदलने की क्षमता रखते हैं। यूकैरियोटिक मेजबानों में रोगजनकों द्वारा जीन पहुँचाने की कला को बेहतर ढंग से समझने से यह ज्ञान उत्पन्न हुआ है कि इन रोगजनकों के उपकरणों को मानव हित के लिए उपयोगी सदिशों में बदला जा सकता है। Agrobacterium tumifaciens के ट्यूमर उत्पन्न करने वाले (Ti) प्लाज्मिड को अब एक क्लोनिंग सदिश में संशोधित किया गया है जो अब पौधों के लिए रोगजनक नहीं है, लेकिन अभी भी विभिन्न पौधों में हमारे इच्छित जीन पहुँचाने के लिए उन तंत्रों का उपयोग करने में सक्षम है। इसी तरह, रेट्रोवायरसों को भी निष्क्रिय कर दिया गया है और अब इन्हें पशु कोशिकाओं में वांछनीय जीन पहुँचाने के लिए उपयोग किया जाता है। इसलिए, एक बार जब कोई जीन या DNA खंड उपयुक्त सदिश में लिगेट कर दिया जाता है, तो इसे एक बैक्टीरियल, पौधे या पशु मेजबान में स्थानांतरित किया जाता है (जहाँ यह गुणित होता है)।

11.2.3 सक्षम मेजबान (पुनःसंयुक्त DNA के साथ रूपांतरण के लिए)

चूँकि DNA एक जलप्रेही अणु है, यह कोशिका झिल्ली से नहीं गुजर सकता। क्यों? जीवाणुओं को प्लाज्मिड ग्रहण करने के लिए मजबूर करने के लिए, जीवाणु कोशिकाओं को पहले DNA ग्रहण करने के लिए ‘सक्षम’ बनाना होता है। यह उन्हें कैल्शियम जैसे द्विसंयोजी धनायन की एक विशिष्ट सांद्रता के साथ उपचारित करके किया जाता है, जो DNA के जीवाणु की कोशिका भित्ति में छिद्रों के माध्यम से प्रवेश करने की दक्षता बढ़ाता है। फिर पुनःसंयोजी DNA को ऐसी कोशिकाओं में डाला जा सकता है—कोशिकाओं को बर्फ पर पुनःसंयोजी DNA के साथ इनक्यूबेट करके, फिर उन्हें संक्षेप में 42°C पर रखकर (उष्मा आघात), और फिर वापस बर्फ पर रखकर। इससे जीवाणु पुनःसंयोजी DNA ग्रहण कर पाते हैं।

यह विदेशी DNA को मेज़बान कोशिकाओं में पहुँचाने का एकमात्र तरीका नहीं है। एक विधि, जिसे सूक्ष्म-इंजेक्शन कहा जाता है, में पुनःसंयोजी DNA को सीधे एक पशु कोशिका के केंद्रक में इंजेक्ट किया जाता है। एक अन्य विधि, जो पौधों के लिए उपयुक्त है, में कोशिकाओं को उच्च वेग वाले सोने या टंगस्टन के सूक्ष्म कणों से बमबारी की जाती है, जो DNA से लेपित होते हैं; इसे बायोलिस्टिक्स या जीन गन विधि कहा जाता है। और अंतिम विधि ‘निष्क्रिय रोगजनक’ वाहक का उपयोग करती है, जो कोशिका को संक्रमित करने पर पुनःसंयोजी DNA को मेज़बान में स्थानांतरित कर देते हैं।

अब जबकि हमने पुनःसंयोजी DNA निर्माण के उपकरणों के बारे में सीख लिया है, आइए पुनःसंयोजी DNA प्रौद्योगिकी की सुविधा प्रदान करने वाली प्रक्रियाओं पर चर्चा करें।

11.3 पुनःसंयोजी DNA प्रौद्योगिकी की प्रक्रियाएँ

पुनः संयोजी डीएनए प्रौद्योगिकी में डीएएनए के पृथक्करण, प्रतिबंधक एंडोन्यूक्लिएजेज़ द्वारा डीएनए के खंडन, वांछित डीएनए खंड का पृथक्करण, वेक्टर में डीएनए खंड का लिगेशन, पुनः संयोजी डीएनए को होस्ट में स्थानांतरण, होस्ट कोशिकाओं को बड़े पैमाने पर माध्यम में संवर्धन और वांछित उत्पाद के निष्कर्षण जैसे कई चरण निश्चित क्रम में शामिल होते हैं। आइए इनमें से प्रत्येक चरण का कुछ विवरण से परीक्षण करें।

11.3.1 आनुवंशिक पदार्थ (डीएनए) का पृथक्करण

याद कीजिए कि न्यूक्लिक अम्ल सभी जीवों का आनुवंशिक पदार्थ है बिना किसी अपवाद के। अधिकांश जीवों में यह डीऑक्सीराइबोन्यूक्लिक अम्ल या DNA होता है। DNA को प्रतिबंधक एंजाइमों द्वारा काटने के लिए, इसे शुद्ध रूप में होना चाहिए, अन्य बड़े अणुओं से मुक्त। चूंकि DNA झिल्लियों के भीतर बंद होता है, हमें कोशिका को खोलना पड़ता है ताकि DNA को RNA, प्रोटीन, पॉलीसैकेराइड और लिपिड्स जैसे अन्य बड़े अणुओं के साथ मुक्त किया जा सके। यह बैक्टीरियल कोशिकाओं/पौधों या जानवरों के ऊतकों को लाइसोज़ाइम (बैक्टीरिया), सेल्युलेज (पौधे की कोशिकाएं), काइटिनेज (कवक) जैसे एंजाइमों के साथ उपचारित करके प्राप्त किया जा सकता है। आप जानते हैं कि जीन लंबे DNA अणुओं पर स्थित होते हैं जो प्रोटीन जैसे हिस्टोन से जुड़े होते हैं। RNA को राइबोन्यूक्लिएस के साथ उपचारित करके हटाया जा सकता है जबकि प्रोटीन को प्रोटिएस के साथ उपचारित करके हटाया जा सकता है। अन्य अणुओं को उपयुक्त उपचारों द्वारा हटाया जा सकता है और शुद्ध DNA अंततः ठंडे एथेनॉल की अतिरिक्ति के बाद अवक्षेपित हो जाता है। इसे निलंबन में बारीक धागों के समूह के रूप में देखा जा सकता है (चित्र 11.5)।

चित्र 11.5 अलग होने वाला DNA स्पूलिंग द्वारा निकाला जा सकता है

11.3.2 विशिष्ट स्थानों पर DNA को काटना

प्रतिबंधक एंजाइम डाइजेशन उस विशिष्ट एंजाइम के लिए इष्टतम परिस्थितियों में शुद्ध डीएनए अणुओं को प्रतिबंधक एंजाइम के साथ इनक्यूबेट करके किया जाता है। एक प्रतिबंधक एंजाइम डाइजेशन की प्रगति की जांच के लिए एगारोस जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस का उपयोग किया जाता है। डीएनए एक ऋणात्मक आवेशित अणु है, इसलिए यह धनात्मक इलेक्ट्रोड (ऐनोड) की ओर बढ़ता है (चित्र 11.3)। यह प्रक्रिया वेक्टर डीएनए के साथ भी दोहराई जाती है।

डीएनए की जोड़ने में कई प्रक्रियाएं शामिल होती हैं। स्रोत डीएनए और वेक्टर डीएनए दोनों को एक विशिष्ट प्रतिबंधक एंजाइम से काटने के बाद, स्रोत डीएनए से काटा गया ‘रुचि का जीन’ और खुले स्थान के साथ काटा गया वेक्टर मिलाया जाता है और लाइगेज जोड़ा जाता है। इससे पुनः संयोजी डीएनए तैयार होता है।

11.3.3 पीसीआर का उपयोग करके रुचि के जीन का प्रवर्धन

पीसीआर का अर्थ है पॉलिमरेज़ चेन रिएक्शन। इस अभिक्रिया में, रुचि के जीन (या डीएनए) की कई प्रतियाँ इन विट्रो में दो प्राइमर सेटों (छोटे रासायनिक रूप से संश्लेषित ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स जो डीएनए के क्षेत्रों के पूरक होते हैं) और एंजाइम डीएनए पॉलिमरेज़ का उपयोग करके संश्लेषित की जाती हैं। यह एंजाइम प्राइमरों का विस्तार अभिक्रिया में दिए गए न्यूक्लियोटाइड्स और जीनोमिक डीएनए को टेम्प्लेट के रूप में उपयोग करके करता है। यदि डीएनए की प्रतिकृति की प्रक्रिया को कई बार दोहराया जाता है, तो डीएनए के खंड को लगभग एक अरब गुना तक प्रवर्धित किया जा सकता है, अर्थात् 1 अरब प्रतियाँ बनाई जाती हैं। ऐसा बार-बार प्रवर्धन एक थर्मोस्टेबल डीएनए पॉलिमरेज़ (एक जीवाणु, थर्मस एक्वाटिकस से पृथक किया गया) के उपयोग से प्राप्त किया जाता है, जो डबल स्ट्रैंडेड डीएनए के उच्च तापमान प्रेरित डीनेचुरेशन के दौरान सक्रिय रहता है। यदि वांछित हो तो प्रवर्धित खंड को अब एक वेक्टर के साथ लिगेट करके आगे क्लोनिंग के लिए उपयोग किया जा सकता है (चित्र 11.6)।

चित्र 11.6 पॉलिमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर): प्रत्येक चक्र में तीन चरण होते हैं: (i) डीनेचुरेशन; (ii) प्राइमर ऐनीलिंग; और (iii) प्राइमरों का विस्तार

11.3.4 पुनः संयोजी डीएनए को होस्ट सेल/जीव में सम्मिलित करना

लिगेटेड डीएनए को रेसिपिएंट कोशिकाओं में पेश करने के कई तरीके होते हैं। रेसिपिएंट कोशिकाओं को ‘कॉम्पिटेंट’ बनाने के बाद, वे अपने आस-पास मौजूद डीएनए को ग्रहण कर लेती हैं। इसलिए, यदि किसी रेकॉम्बिनेंट डीएनए में किसी एंटीबायोटिक (जैसे एम्पीसिलिन) के प्रतिरोध के लिए जीन होता है और उसे ई. कोलाई कोशिकाओं में स्थानांतरित किया जाता है, तो होस्ट कोशिकाएं एम्पीसिलिन-प्रतिरोधी कोशिकाओं में बदल जाती हैं। यदि हम ट्रांसफॉर्म की गई कोशिकाओं को एम्पीसिलिन युक्त आगर प्लेटों पर फैलाएं, तो केवल ट्रांसफॉर्मेंट्स ही बढ़ेंगे, अनट्रांसफॉर्म्ड रेसिपिएंट कोशिकाएं मर जाएंगी। चूंकि एम्पीसिलिन प्रतिरोध जीन के कारण, एम्पीसिलिन की उपस्थिति में ट्रांसफॉर्म्ड कोशिका का चयन किया जा सकता है। इस मामले में एम्पीसिलिन प्रतिरोध जीन को चयन योग्य मार्कर कहा जाता है।

11.3.5 विदेशी जीन उत्पाद प्राप्त करना

जब आप किसी क्लोनिंग वेक्टर में विदेशी डीएनए का एक टुकड़ा डालते हैं और उसे किसी जीवाणु, पादप या पशु कोशिका में स्थानांतरित करते हैं, तो विदेशी डीएनए की प्रतिकृति होती है। लगभग सभी रेकॉम्बिनेंट तकनीकों में अंतिम उद्देश्य कोई वांछित प्रोटीन बनाना होता है। इसलिए, रेकॉम्बिनेंट डीएनए के व्यक्त होने की आवश्यकता होती है। उपयुक्त परिस्थितियों में विदेशी जीन व्यक्त होता है। होस्ट कोशिकाओं में विदेशी जीनों की अभिव्यक्ति में कई तकनीकी विवरणों को समझना शामिल होता है।

जीन को क्लोन करने और लक्षित प्रोटीन के अभिव्यक्ति को प्रेरित करने की स्थितियों को अनुकूलित करने के बाद, इसे बड़े पैमाने पर उत्पादन करने पर विचार करना पड़ता है। क्या आप सोच सकते हैं कि बड़े पैमाने पर उत्पादन की आवश्यकता क्यों है? यदि कोई प्रोटीन कोडिंग जीन विषमजाती होस्ट में व्यक्त किया जाता है, तो इसे पुनःसंयोजी प्रोटीन कहा जाता है। रुचि के क्लोन किए गए जीन वाली कोशिकाओं को प्रयोगशाला में छोटे पैमाने पर उगाया जा सकता है। संस्कृतियों का उपयोग वांछित प्रोटीन को निकालने और फिर विभिन्न पृथक्करण तकनीकों का उपयोग करके इसे शुद्ध करने के लिए किया जा सकता है।

कोशिकाओं को एक सतत संवर्धन प्रणाली में भी गुणा किया जा सकता है जिसमें प्रयुक्त माध्यम को एक ओर से निकाला जाता है जबकि ताजा माध्यम दूसरी ओर से जोड़ा जाता है ताकि कोशिकाओं को उनके शारीरिक रूप से सबसे सक्रिय लॉग/घातांकीय चरण में बनाए रखा जा सके। इस प्रकार की संवर्धन विधि अधिक जैव द्रव्यवर्धन उत्पन्न करती है जिससे वांछित प्रोटीन की उच्च उपज प्राप्त होती है।

छोटी मात्रा की संस्कृतियाँ उत्पादों की उल्लेखनीय मात्रा नहीं दे सकतीं। बड़ी मात्रा में उत्पादन करने के लिए, बायोरिएक्टरों का विकास आवश्यक था, जहाँ संस्कृति की बड़ी मात्राएँ (100-1000 लीटर) संसाधित की जा सकती हैं। इस प्रकार, बायोरिएक्टरों को ऐसे पात्रों के रूप में सोचा जा सकता है जिनमें कच्चे माल को जैविक रूप से विशिष्ट उत्पादों, व्यक्तिगत एंजाइमों आदि में रूपांतरित किया जाता है, जिसमें सूक्ष्मजीव, पौधे, पशु या मानव कोशिकाओं का उपयोग किया जाता है। एक बायोरिएक्टर इष्टतम वृद्धि की स्थितियाँ (तापमान, pH, सब्सट्रेट, लवण, विटामिन, ऑक्सीजन) प्रदान करके वांछित उत्पाद को प्राप्त करने के लिए इष्टतम परिस्थितियाँ प्रदान करता है।

सबसे अधिक प्रयोग किए जाने वाले बायोरिएक्टर हिलाने वाले प्रकार के होते हैं, जिन्हें चित्र 11.7 में दिखाया गया है।

चित्र 11.7 (क) सरल हिलाने वाला टैंक बायोरिएक्टर; (ख) स्पार्ज किया हुआ हिलाने वाला टैंक बायोरिएक्टर जिसके माध्यम से बाँझ वायु बुलबुले स्पार्ज किए जाते हैं

एक हिलाने वाला टैंक रिएक्टर आमतौर पर बेलनाकार होता है या फिर इसका आधार वक्र होता है ताकि रिएक्टर की सामग्री को मिलाने में सुविधा हो। स्टिरर समान रूप से मिश्रण और पूरे बायोरिएक्टर में ऑक्सीजन की उपलब्धता सुनिश्चित करता है। वैकल्पिक रूप से रिएक्टर के माध्यम से वायु बुलबुले भेजी जा सकती है। यदि आप चित्र को ध्यान से देखें तो आप देखेंगे कि बायोरिएक्टर में एक एजिटेटर सिस्टम, एक ऑक्सीजन डिलीवरी सिस्टम और एक फोम नियंत्रण प्रणाली, एक तापमान नियंत्रण प्रणाली, pH नियंत्रण प्रणाली और सैंपलिंग पोर्ट हैं ताकि संस्कृति के छोटे-छोटे आयतन समय-समय पर निकाले जा सकें।

11.3.6 डाउनस्ट्रीम प्रोसेसिंग

जैवसंश्लेषण चरण के पूर्ण होने के बाद, उत्पाद को तैयार उत्पाद के रूप में विपणन के लिए तैयार होने से पहले कई प्रक्रियाओं से गुजरना पड़ता है। इन प्रक्रियाओं में पृथक्करण और शुद्धिकरण शामिल हैं, जिन्हें सामूहिक रूप से डाउनस्ट्रीम प्रोसेसिंग कहा जाता है। उत्पाद को उपयुक्त संरक्षक के साथ तैयार किया जाना चाहिए। ऐसे तैयार किए गए उत्पाद को दवाओं की तरह पूर्ण नैदानिक परीक्षणों से गुजरना होता है। प्रत्येक उत्पाद के लिए सख्त गुणवत्ता नियंत्रण परीक्षण भी आवश्यक है। डाउनस्ट्रीम प्रोसेसिंग और गुणवत्ता नियंत्रण परीक्षण उत्पाद से उत्पाद में भिन्न होते हैं।

सारांश

जैवप्रौद्योगिकी जीवित जीवों, कोशिकाओं या एंजाइमों का उपयोग कर उत्पादों और प्रक्रियाओं के बड़े पैमाने पर उत्पादन और विपणन से संबंधित है। आधुनिक जैवप्रौद्योगिकी, जो जेनेटिकली संशोधित जीवों का उपयोग करती है, तभी संभव हो सकी जब मनुष्य ने डीएनए की रसायनिक संरचना को बदलना और पुनः संयोजक डीएनए बनाना सीखा। इस प्रमुख प्रक्रिया को पुनः संयोजक डीएनए प्रौद्योगिकी या आनुवंशिक इंजीनियरिंग कहा जाता है। इस प्रक्रिया में प्रतिबंधन एंडोन्यूक्लिएसेज़, डीएनए लाइगेज़, उपयुक्त प्लाज्मिड या वायरल वेक्टरों का उपयोग कर विदेशी डीएनए को मेजबान जीव में पहुंचाना, विदेशी जीन की अभिव्यक्ति, जीन उत्पाद अर्थात कार्यात्मक प्रोटीन की शुद्धि और अंत में विपणन के लिए उपयुक्त तैयारी बनाना शामिल है। बड़े पैमाने पर उत्पादन में बायोरिएक्टरों का उपयोग होता है।