पुनर्संयोजी डीएनए प्रौद्योगिकी एक दो-घटक प्रणाली है जिसमें एक संगत मेज़बान और एक वेक्टर शामिल होते हैं। जीन क्लोनिंग के लिए विभिन्न प्रकार के मेज़बान और वेक्टर उपलब्ध हैं। इस अध्याय में, छात्रों को rDNA प्रौद्योगिकी में प्रयुक्त विभिन्न प्रकार के प्रोकैरियोटिक और यूकैरियोटिक मेज़बानों और वेक्टरों की मूल बातों से परिचित कराया जाएगा।

2.1 पुनर्संयोजी डीएनए प्रौद्योगिकी के दो प्रमुख घटक

जैसा कि पिछले अध्याय (अध्याय 1) में चर्चा की गई थी, rDNA प्रौद्योगिकी दो भिन्न डीएनए अणुओं को विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए जीनों को पृथक करने, प्रचारित करने, वर्णन करने और हेरफेर करने के उद्देश्य से जोड़ने को संदर्भित करती है। यह तकनीक दो प्रमुख चरणों में शामिल होती है (चित्र 2.1)। पहले चरण में, वांछित डीएनए अणु, जिसे सामान्यतः सम्मिलन (लक्ष्य जीन) कहा जाता है, स्रोत से पृथक किया जाता है। दूसरे चरण में, इस लक्ष्य जीन को एक सुविधाजनक वाहक डीएनए अणु, जिसे वेक्टर कहा जाता है, में सम्मिलित किया जाता है। सम्मिलन युक्त वेक्टर को पुनर्संयोजी डीएनए (rDNA) कहा जाता है। तत्पश्चात, rDNA को एक जीव में प्रस्तुत किया जाता है जिसे मेज़बान कहा जाता है। मेज़बान की आनुवंशिक मशीनरी का उपयोग करते हुए, rDNA प्रचार और अभिव्यक्ति से गुजरता है। rDNA प्रौद्योगिकी की इस संपूर्ण प्रक्रिया को ‘जीन क्लोनिंग’ शब्द के अंतर्गत शामिल किया जाता है। इस प्रकार, जीन क्लोनिंग को एक दो-घटक प्रणाली माना जा सकता है: एक संगत मेज़बान और एक वेक्टर, जहाँ वेक्टर उन आवश्यक अनुक्रम प्रदान करता है जो एक संगत मेज़बान में इसकी प्रतिकृति के लिए आवश्यक होते हैं, जो विभिन्न प्रतिकृति कार्य (एंजाइम और प्रोटीन) प्रदान करता है।

2.2 मेज़बान (Host)

जीन क्लोनिंग के लिए बड़ी संख्या में मेज़बान जीव, प्रोकैरियोटिक और यूकैरियोटिक दोनों, प्रयोग किए जाते हैं (चित्र 2.2)। एक मेज़बान को rDNA को कोशिका में आसानी से प्रवेश करने देना चाहिए और उसे पुनःसंयुक्त DNA को विदेशी DNA मानकर उसे नष्ट नहीं करना चाहिए। मेज़बान को वेक्टर DNA के साथ-साथ सम्मिलित अनुक्रम की सहज प्रतिकृति के लिए आवश्यक सभी एंजाइम और प्रोटीन आपूर्ति करने होंगे। मेज़बान के रूप में विस्तृत विविधता में आनुवंशिक रूप से परिभाषित उपभेद उपलब्ध हैं।

प्रोकैरियोटिक मेज़बानों में, Escherichia coli (E. coli) सबसे अधिक प्रयोग किया जाता है। सामान्य E. coli एक छड़ाकार ग्राम-ऋणात्मक जीवाणु है जो सामान्यतः उष्मरक्त जीवों के निचले आंत्र में पाया जाता है। यह तेजी से प्रजनन और वृद्धि कर सकता है, लगभग हर 20 मिनट में अपनी जनसंख्या दोगुनी कर देता है। E. coli का K12 उपभेद जीन क्लोनिंग में सबसे अधिक प्रयोग होने वाले मेज़बानों में से एक है। अन्य प्रोकैरियोटिक मेज़बान भी विकसित किए गए हैं। उदाहरण के लिए, Bacillus subtilis एक महत्वपूर्ण वैकल्पिक मेज़बान है, जहाँ उद्देश्य क्लोन किए गए जीन द्वारा कोडित प्रोटीन का स्राव है। यूकैरियोटिक मेज़बानों में सबसे अधिक प्रयोग होने वाला यीस्ट है।

2.3 वेक्टर (Vector)

सिद्धांततः कोई भी DNA अणु, जो मेज़बान कोशिका के अंदर स्वयं की प्रतिकृति बना सकता है, जीन क्लोनिंग के लिए वेक्टर के रूप में कार्य कर सकता है। हालांकि, एक प्लाज्मिड के वेक्टर के रूप में कार्य करने के लिए, उसे निम्नलिखित लक्षण पूरे करने होंगे:

1. मेज़बान कोशिका में आसानी से समाहित होने के लिए, एक वेक्टर स्वयं आकार में छोटा होना चाहिए और बड़े आकार के समावेश को समाहित करने में सक्षम होना चाहिए।

2. वेक्टर में प्रतिकृतिकरण का उद्गम या ori होना चाहिए, ताकि वेक्टर मेज़बान जीव के अंदर स्वतंत्र रूप से प्रतिकृतिकरण कर सके।

3. वेक्टर में अद्वितीय प्रतिबंधन स्थल होने चाहिए। यदि इसमें बहुत अधिक प्रतिबंधन स्थल हों, तो यह कई टुकड़ों में विखंडित हो जाएगा।

4. वेक्टर में एक चयन योग्य चिह्न होना चाहिए। चयन योग्य चिह्न रूपांतरित जीवों को छांटने के लिए आवश्यक होते हैं [उदाहरण: टेट्रासाइक्लिन $\left(t e t^{R}\right)$, ऐम्पिसिलिन $\left(a m p^{R}\right)$ जैसे प्रतिजैविकों के प्रति प्रतिरोध]।

विभिन्न प्रकार के वेक्टर, प्रोकैरियोटिक और यूकैरियोटिक दोनों उपलब्ध हैं (चित्र 2.2)।

चित्र 2.2: जीन क्लोनिंग की दो घटक प्रणाली जो विभिन्न प्रकार के यूकैरियोटिक और प्रोकैरियोटिक मेज़बानों और वेक्टरों को दर्शाती है

2.3.1 वेक्टर के रूप में प्लाज्मिड

प्लाज्मिड वृत्ताकार, द्विकुंडलित (ds), गुणसूत्र-बाह्य DNAs होते हैं जो स्वतंत्र प्रतिकृतिकरण में सक्षम होते हैं। ये स्वाभाविक रूप से कई जीवाणुओं, आर्किया और यहाँ तक कि यूकैरियोट्स, जैसे कि यीस्ट में पाए जाते हैं। प्लाज्मिड्स का आकार कुछ हजार बेस जोड़ों से लेकर 100 किलोबेस जोड़ों (kbp) से अधिक तक होता है। मेज़बान कोशिका के गुणसूत्रीय DNA की तरह, प्लाज्मिड DNA को भी हर कोशिका विभाजन से पहले द्विगुणित किया जाता है। कोशिका विभाजन के दौरान, प्लाज्मिड DNA की कम से कम एक प्रति प्रत्येक पुत्री कोशिका में विभाजित हो जाती है, जिससे मेज़बान कोशिका की क्रमिक पीढ़ियों के माध्यम से प्लाज्मिड के निरंतर प्रचार की गारंटी मिलती है। कुछ प्लाज्मिड गुणसूत्रों में समाकलित हो सकते हैं। ऐसे प्लाज्मिडों को एपिसोम कहा जाता है।

कई स्वाभाविक रूप से पाए जाने वाले प्लाज्मिड्स में ऐसे जीन होते हैं जो मेज़बान कोशिका को कुछ लाभ प्रदान करते हैं। उदाहरण के लिए, कुछ जीवाणु प्लाज्मिड्स ऐसे एंजाइमों को कूटबद्ध करते हैं जो प्रतिजैविकों, जैसे कि ऐम्पिसिलिन, टेट्रासाइक्लिन क्लोरैम्फेनिकॉल को निष्क्रिय करते हैं। ऐसे औषधि-प्रतिरोध प्रदान करने वाले प्लाज्मिड्स (जिन्हें R-प्लाज्मिड्स कहा जाता है) जीन क्लोनिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले प्लाज्मिड्स की एक प्रमुख श्रेणी हैं। प्लाज्मिड्स की एक अन्य श्रेणी विषाक्त पदार्थों की एक विविधता उत्पन्न करती है जिन्हें ‘कोलिसिन’ कहा जाता है जो अन्य जीवाणुओं को मारते हैं (जिन्हें कोल प्लाज्मिड्स कहा जाता है)। कुछ प्लाज्मिड्स में ‘स्थानांतरण जीन’ होते हैं जो प्रोटीनों को कूटबद्ध करते हैं जो एक बृहत अणु नलिका, या पिलस बना सकते हैं, जिसके माध्यम से प्लाज्मिड की एक प्रति समान या संबंधित जीवाणु प्रजातियों की अन्य मेज़बान कोशिकाओं में स्थानांतरित की जा सकती है (जिन्हें F-प्लाज्मिड्स कहा जाता है)। इसी प्रकार, प्लाज्मिड्स को प्रति प्रति संख्या के आधार पर भी वर्गीकृत किया जा सकता है और इस प्रकार वर्गीकृत किया जाता है:

(a) उच्च या बहु-प्रतिलिपि प्लाज्मिड: इन प्लाज्मिडों की प्रतिकृत्ति और विभाजन जीवाण्विक गुणसूत्रीय डीएनए की प्रतिकृत्ति के नियंत्रण से मुक्त होती है, जिससे प्रति कोशिका इन प्लाज्मिडों की कई प्रतियाँ (10-30 प्रतियाँ) हो सकती हैं [चित्र 2.3(a)]।

चित्र 2.3: (a) उच्च प्रतिलिपि प्लाज्मिड (b) निम्न प्रतिलिपि प्लाज्मिड

इन प्लाज्मिडों की प्रतिकृत्ति को शिथिल प्रतिकृत्ति कहा जाता है। उच्च प्रतिलिपि संख्या वाले प्लाज्मिड के उपयोग से पुनः संयोजी जीवों की स्क्रीनिंग के दौरान उच्च उपज और संकेतों की बढ़ी हुई तीव्रता प्राप्त होती है।

(b) निम्न या एकल प्रतिलिपि प्लाज्मिड: इन प्लाज्मिडों की प्रतिकृत्ति और विभाजन जीवाण्विक गुणसूत्रीय डीएनए की प्रतिकृत्ति के समान नियंत्रण में होती है। इसके परिणामस्वरूप, इन प्लाज्मिडों की प्रतिलिपि संख्या प्रति कोशिका केवल एक या कुछ प्रतियों तक सीमित रहती है (चित्र 2.3(b))। इन प्लाज्मिडों की प्रतिकृत्ति को कठोर प्रतिकृत्ति कहा जाता है।

प्लाज्मिड आधारित वेक्टरों का विकास

प्लाज्मिड्स को वेक्टर के रूप में उपयोग करने और उनकी उपयोगिता को सामान्य उद्देश्यों के लिए या विशिष्ट प्रयोगात्मक डिज़ाइनों के अनुरूप बढ़ाने के लिए, प्रकृति में मूल रूप से पाए जाने वाले प्लाज्मिड्स को संशोधित, छोटा किया गया, पुनर्निर्मित और पुनः संयोजित किया जाता है — दोनों in vivo और in vitro — ताकि उपरोक्त गुणों को उनमें सम्मिलित किया जा सके। उदाहरण के लिए, प्लाज्मिड आधारित वेक्टर pBR313, जो शिथिल तरीके से प्रतिकृत होता है (उच्च प्रति संख्या उत्पन्न करता है), दो चयन योग्य मार्करों $t t^{R}$ और $a m p^{R}$ को धारण करता है (चयन योग्य मार्कर अन्य दो प्राकृतिक रूप से होने वाले प्लाज्मिड्स से प्राप्त किए गए थे) और कई अद्वितीय प्रतिबंधन स्थलों (क्लोनिंग स्थलों) को वहन करता है। हालांकि, इस प्लाज्मिड का आकार $9 \mathrm{~kb}$ था, जो अनावश्यक रूप से बड़ा था। यह देखा गया कि इसकी DNA का आधे से अधिक भाग वेक्टर के रूप में इसकी भूमिका के लिए आवश्यक नहीं था। इसलिए, इस प्लाज्मिड वेक्टर विकास का पहला चरण वेक्टर pBR322 के निर्माण की ओर ले गया, जिसका आकार 4,361 bp तक घटा दिया गया — pBR313 के अधिकांश अनावश्यक अनुक्रमों को हटाकर। वेक्टर pBR322 जीन क्लोनिंग के लिए सबसे व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले वेक्टर बन गया (चित्र 2.4)।

चित्र 2.4: pBR322 का वेक्टर मानचित्र जो प्रतिकरण मूल (ori), प्रतिबंधन एंजाइमों के लिए अद्वितीय क्लोनिंग स्थलों (PstI, EcoRI, BamHI, SalI, PvuII) और एंटीबायोटिक चयन मार्कर जीनों $(a m p^{R}$ और tet $\left.{ }^{R}\right)$ को दर्शाता है।

उत्तरोत्तर विकास में संश्लेषिक (synthetic) क्लोनिंग साइट्स को प्रस्तुत किया गया, जिन्हें मल्टिपल क्लोनिंग साइट (MCS) या पॉली क्लोनिंग साइट या पॉलीलिंकर कहा जाता है। MCS एक छोटा संश्लेषिक DNA खंड होता है जिसमें बड़ी संख्या में अद्वितीय प्रतिबंधन साइट्स (restriction sites) होती हैं। इससे किसी भी इन प्रतिबंधन एंजाइमों द्वारा काटे गए विदेशी DNA को उस क्षेत्र में सम्मिलित करना संभव होता है (चित्र 2.5)।

आगे के विकास में सरल और सुविधाजनक चयन चिन्हकों (selection markers) की प्रस्तुति हुई। उदाहरणस्वरूप, ब्लू/व्हाइट चयन (blue/white selection) के आधार पर रीकॉम्बिनेंट्स का चयन प्रस्तावित किया गया (विस्तार के लिए अनुभाग 3.5; अध्याय 3 देखें), जिसने E. coli के β-गैलेक्टोसिडेस (lacZ) का उपयोग करके रीकॉम्बिनेंट्स के चयन को सरल बना दिया। इस प्रकार के एक उन्नत क्लोनिंग वेक्टर का सामान्य उदाहरण pUC19 वेक्टर है, जैसा कि चित्र 2.5 में दिखाया गया है। E. coli में जीन क्लोनिंग के लिए अनेक अन्य प्लाज्मिड भी वेक्टर के रूप में प्रयुक्त होते हैं।

चित्र 2.5: pUC19 का वेक्टर मानचित्र जिसमें प्रतिकृति उत्पत्ति अनुक्रम (ori), ऐम्पिसिलिन प्रतिरोध जीन (amp^R), β-गैलेक्टोसिडेस जीन (lacZ) का भाग दिखाया गया है।

2.3.2 वेक्टर के रूप में बैक्टीरियोफेज

जीन क्लोनिंग के लिए वेक्टरों की एक अन्य महत्वपूर्ण श्रेणी बैक्टीरियोफेजों (फेजों) के जीनोम से प्राप्त होती है, अर्थात् ऐसे वायरस जो जीवाणु कोशिकाओं को संक्रमित करते हैं। सामान्यतः, बैक्टीरियोफेज वेक्टर बड़े सम्मिलनों को क्लोन करने में प्लाज्मिडों की तुलना में अधिक कुशल होते हैं, और किसी विशिष्ट वांछित सम्मिलन के लिए जीवाणु कॉलोनियों की स्क्रीनिंग की तुलना में बड़ी संख्या में बैक्टीरियोफेज प्लेक्स (फेज संक्रमण के कारण लाइस्ड जीवाणु कोशिकाएँ) की स्क्रीनिंग करना अधिक सरल होता है। बैक्टीरियोफेज लैम्बडा $(\lambda)$ और M13 दो सबसे सामान्य फेज हैं जिनके जीनोम का उपयोग $E$. coli मेज़बान के लिए क्लोनिंग वेक्टर बनाने में प्रायः किया गया है। इनका वर्णन निम्नलिखित अनुभाग में किया गया है।

लैम्ब्डा $(\lambda)$ फेज वेक्टर

बैक्टीरियोफेज लैम्ब्डा, एक ऐसा वायरस जो $E$. coli को संक्रमित करता है, को क्लोनिंग वेक्टर के रूप में व्यापक रूप से प्रयोग किया गया है। यह वायरस प्रचारित करने में आसान है, और इसलिए, लंबे समय से एक मॉडल सिस्टम रहा है। इसमें एक सिर (कैप्सिड) और एक पूंछ होती है (चित्र 2.6)। सिर में फेज जीनोम होता है। फेज कण $E$. coli की सतह से जुड़ते हैं और अपने जीनोम को पूंछ के माध्यम से बैक्टीरियल कोशिका के साइटोप्लाज्म में डालते हैं। लैम्ब्डा फेज एक ऐसा वायरस है जिसके जीवन चक्र में लाइटिक और लाइसोजेनिक दोनों विकल्प होते हैं (चित्र 2.7)। आमतौर पर, ‘लाइटिक चक्र’ का अनुसरण किया जाता है, जहां लैम्ब्डा डीएनए की प्रतिकृति होती है और नए फेज कण कोशिका के भीतर उत्पन्न होते हैं। इससे कोशिका विघटन होता है और नवनिर्मित फेज कण बाहर निकलते हैं। हालांकि, कुछ परिस्थितियों में, फेज डीएनए स्वयं को होस्ट कोशिका के गुणसूत्र में सम्मिलित कर सकता है लाइसोजेनिक पथ में। इस अवस्था में, $\lambda$ डीएनए को प्रोफेज कहा जाता है और यह होस्ट के जीनोम में निवासी रहता है बिना होस्ट को स्पष्ट नुकसान पहुंचाए।

चित्र 2.6: लैम्ब्डा बैक्टीरियोफेज

लाइटिक चक्र

चित्र 2.7: लैम्ब्डा फेज के लाइटिक और लाइसोजेनिक जीवन चक्र

$\lambda$ फेज जीनोम रैखिक द्वि-स्त्रंदीय DNA है जिसमें 48,490 आधार युग्म होते हैं। प्रत्येक सिरे पर 12 आधारों का एकल-स्त्रंदीय खंड होता है जिसे cos अनुक्रम (सम्मिलन सिरे) कहा जाता है। दोनों सम्मिलन सिरे एक-दूसरे के पूरक होते हैं। $\lambda$ जीनोम में प्रतिकृत्ति उत्पत्ति स्थल, वायरल सिरा और पूंछ प्रोटीनों के जीन, तथा विलytic और lysogenic चक्रों में संलग्न प्रतिकृत्ति एंजाइम होते हैं। $\lambda$ जीनोम फे�ज सिरे के भीतर रैखिक रहता है (चित्र 2.8 (a))। एक बार $E$. coli मेज़बान कोशिका के अंदर पहुँचने पर, cos अनुक्रम आपस में जोड़ लेते हैं और सम्मिलन सिरे मेज़बान एंजाइम द्वारा एक साथ लाइगेट होकर लैम्ब्डा जीनोम की वृत्ताकार संस्कृति बनाते हैं (चित्र 2.8 (b))। सील किया गया सम्मिलन सिरे को cos स्थल कहा जाता है (चित्र 2.8 (b))। दोनों सिरों पर मौजूद 12 न्यूक्लियोटाइड लंबे एकल-स्त्रंदीय DNA आपस में जोड़ लेते हैं और द्वि-स्त्रंदीय DNA बनाते हैं। इस प्रकार, अपने वृत्ताकार रूप में फेज जीनोम की लंबाई 48,502 आधार युग्म होती है। फेज $\lambda$ जीनोम को मेज़बान गुणसूत्र में सम्मिलित किया जा सकता है और तब इसे प्रोफेज कहा जाता है (चित्र 2.7)।

गुणन के दौरान, फेज जीनोम रोलिंग सर्कल प्रतिकृतिकरण से गुजरता है जिसमें एक टेम्पलेट स्ट्रैंड घूमता है, बहुत सारे λ जीनोम की प्रतियों की एक श्रृंखला को बाहर निकालता है ताकि एक लंबा कॉन्कैटेमर बन सके जो सिरे से सिरे जुड़ा होता है और cos साइट्स द्वारा अलग होता है। कॉन्कैटेमर को cos साइट्स पर काटा जाता है ताकि एक यूनिट का फेज DNA प्राप्त हो सके। इसके बाद प्रत्येक खाली सिरे में λ जीनोम की एकल प्रति को पैक किया जाता है, फिर पूंछ जुड़ती है और नवनिर्मित फेज कणों को जीवाणु कोशिकाओं के लिसिस द्वारा मुक्त किया जाता है (चित्र 2.7)।

लगभग, लैम्ब्डा जीनोम का एक-तिहाई भाग, λ जीनोम का मध्य क्षेत्र (जिसमें लाइसोजेनी के लिए आवश्यक जीन होते हैं) सफल लाइटिक संक्रमण के लिए निरपेक्ष (अनावश्यक) होता है (चित्र 2.8)। इसलिए, लैम्ब्डा फेज DNA से जीन क्लोनिंग के लिए एक वेक्टर बनाने के लिए, मध्य निरपेक्ष क्षेत्र के सभी या कुछ भाग को उपयुक्त लंबाई के एक सम्मिलित खंड से प्रतिस्थापित किया जाता है ताकि पुनर्संयोजी DNA (rDNA) का आकार 38 से 52 kbp के बीच हो ताकि इसे λ सिर में कुशलतापूर्वक पैक किया जा सके।

लैम्ब्डा जीनोम से निकलने वाले विशिष्ट वेक्टर दो व्यापक वर्गों में आते हैं, अर्थात् ‘सम्मिलन वेक्टर’ और ‘प्रतिस्थापन वेक्टर’। सम्मिलन वेक्टरों में सम्मिलित DNA को सम्मिलित करने के लिए एक एकल प्रतिबंध एंजाइम साइट (क्लोनिंग साइट) होती है, जबकि प्रतिस्थापन वेक्टरों में एक जोड़ी क्लोनिंग साइट्स होती हैं जो एक गैर-आवश्यक बैक्टीरियोफेज λ DNA के खंड (केंद्रीय स्टफर क्षेत्र) को घेरती हैं जिसे सम्मिलित DNA द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है।

चित्र 2.8: लैम्ब्डा जीनोम (a) वायरस कण के अंदर रैखिक (b) जीवाणु कोशिका के संक्रमण के बाद वृत्तीय

विभिन्न उद्देश्यों के लिए $\lambda$ वेक्टरों का एक बड़ा सरण निर्मित किया गया है। $E$. coli के लिए कुछ सामान्यतः प्रयुक्त $\lambda$ बैक्टीरियोफेज आधारित वेक्टर नीचे तालिका 2.1 में दिए गए हैं।

तालिका 2.1: $E$. coli मेज़बान के लिए सामान्यतः प्रयुक्त $\lambda$ बैक्टीरियोफेज आधारित वेक्टर।

क्र.सं.	वेक्टर नाम	वेक्टर का प्रकार	पुनर्योजकों का चयन	अधिकतम सम्मिलन आकार (kbp)
1.	$\lambda$ gt10	सम्मिलन वेक्टर	लिटिक (प्लाक निर्माण)	6
2.	$\lambda$ gt11	सम्मिलन वेक्टर	नीला/ सफेद	7.2
3.	$\lambda$ EMBL3	प्रतिस्थापन वेक्टर	लिटिक (प्लाक निर्माण)	20

बैक्टीरियोफेज M13

SSM13 एक नुकीली बैक्टीरियोफेज है जो $E$. coli को संक्रमित करता है। इसका जीनोम एकल स्ट्रैंड वाला गोलाकार DNA है जिसमें लगभग $6.4 \mathrm{~kb}$ न्यूक्लियोटाइड होते हैं और यह नलिका जैसे कैप्सिड में पैक किया जाता है (चित्र 2.9)। लगभग पूरा जीनोम कोट प्रोटीन, वायरल प्रतिकृत्ति और वायरल विधान के लिए आवश्यक जीनों (I-X) को एन्कोड करता है, सिवाय एक छोटे से गैर-आवश्यक क्षेत्र के जो ori के पास स्थित अंतरजीनिक क्षेत्र कहलाता है। बैक्टीरियोफेज M13 केवल उन E. coli कोशिकाओं को संक्रमित करता है जिनमें F प्लाज्मिड होता है। इन कोशिकाओं की झिल्ली से एक नलिका जैसी संरचना ‘पिलस’ फैली होती है। यह पिलस फेज के कोशिका से चिपकने और अवशोषण के लिए आवश्यक होता है (चित्र 2.10)।

चित्र 2.9: M13 बैक्टीरियोफेज (a) एकल स्ट्रैंड जीनोम (b) M13 जीनोम जिसमें विभिन्न जीन I से $X$ दिखाए गए हैं

M13 बैक्टीरियोफेज के जीवन चक्र के दौरान, एकल स्ट्रैंड वाला M13 फेज DNA मेज़बान के अंदर प्रतिकृत्ति करके द्वैध स्ट्रैंड वाली प्रतिकृत्ति रूप (RF) उत्पन्न करता है (चित्र 2.10)। इसके बाद, प्रतिकृत्ति का तरीका बदल जाता है और द्वैध स्ट्रैंड वाले प्रतिकृत्ति रूप से एकल स्ट्रैंड वाला जीनोमिक DNA (+) उत्पन्न होता है (चित्र 2.10)।

चित्र 2.10: बैक्टीरियोफेज M13 का जीवन चक्र

वृत्ताकार एकल स्ट्रैंड जीनोमिक डीएनए (+) को कैप्सिड प्रोटीनों के साथ उनके मेज़बान कोशिका से गुज़रने के दौरान इकट्ठा किया जाता है बिना कोशिका लिसिस के। द्वि-स्ट्रैंड आरएफ डीएनए संक्रमित कोशिकाओं से सरलता से पृथक किया जाता है ताकि वेक्टर के रूप में प्रयुक्त हो सके, और एकल स्ट्रैंड जीनोम प्रचुर मात्रा में ग्रोथ माध्यम में फेज के रूप में उपलब्ध होता है। इस प्रकार, M13 वेक्टर निर्माण के लिए, M13 जीनोम के द्वि-स्ट्रैंड आरएफ का उपयोग किया जाता है। इंटरजेनिक क्षेत्र को सम्मिलित करने के लिए उपयोग किया जाता है ताकि यह M13 प्रतिकृतिकरण में हस्तक्षेप न करे। एक बड़े आकार का डीएनए (42 kb से अधिक) M13 बैक्टीरियोफेज द्वारा क्लोन किया जा सकता है। E. coli के लिए M13 आधारित वेक्टर का एक उदाहरण M13mp18 है जो पुनःसंयोजकों का नीला/सफेद चयन सुविधाजनक बनाता है। आप इस पुस्तक के अध्याय 3 में नीला/सफेद चयन का अध्ययन करेंगे।

2.3.3 कॉस्मिड वेक्टर

एक कॉस्मिड एक प्रकार का संकर (संयोजन) वेक्टर है जो प्लाज़्मिड की तरह प्रतिकृत करता है लेकिन इसे इन विट्रो में लैम्बडा फेज कोट में पैक भी किया जा सकता है। एक विशिष्ट कॉस्मिड में प्रतिकृत कार्य, अद्वितीय प्रतिबंध एंडोन्यूक्लिएस स्थल, और चयनात्मक चिह्न होते हैं जो प्लाज़्मिड डीएनए द्वारा योगदान किए जाते हैं, जिन्हें एक λ डीएनखंड के साथ संयोजित किया जाता है जिसमें जुड़े हुए सुसंगत सिरे (cos स्थल) शामिल होते हैं (चित्र 2.11)। λ डीएनए के केवल 250 bp भी cos संधि प्रदान करने के लिए पर्याप्त होते हैं, जिसमें एक एंजाइम टर्मिनेज द्वारा बाइंडिंग और क्लीवेज के लिए आवश्यक अनुक्रम शामिल होते हैं। अधिकांश कॉस्मिड क्लोनिंग वेक्टरों का लाभ यह है कि वे 45 kbp तक के डीएनए सम्मिलनों को समायोजित कर सकते हैं।

चित्र 2.11: एक विशिष्ट कॉस्मिड वेक्टर

2.3.4 फैज़्मिड्स (फैजेमिड्स)

फैज़्मिड्स फेज और प्लाज्मिड के बीच सच्चे संयोजन (हाइब्रिड) वेक्टर होते हैं। ये रेखीय द्विक-डीएनए होते हैं जिनके सिरे लैम्बडा फेज डीएनए होते हैं जिनमें लाइटिक संक्रमण के लिए आवश्यक सभी जीन होते हैं और जिनका मध्य भाग रेखीय प्लाज्मिड होता है। लैम्बडा फेज और प्लाज्मिड दोनों की प्रतिकृतिकरण क्रियाएँ बरकरार होती हैं (चित्र 2.12)। फैज़्मिड पुनःसंयोजकों को संक्रमण से पहले इन विट्रो में पैक किया जाता है। एक बार ई. कोलाई कोशिका के अंदर पहुँचने पर, फैज़्मिड फेज की तरह प्रतिकृतिकरण कर सकता है और सामान्य तरीके से प्लेक बना सकता है। हालाँकि, यदि वेक्टर में लैम्बडा रिप्रेसर को कूटबद्ध करने वाला जीन होता है, तो फैज़्मिड फेज के बजाय प्लाज्मिड की तरह प्रतिकृतिकरण करता है।

चित्र 2.12: एक विशिष्ट फैज़्मिड वेक्टर

2.4 यूकैरियोटिक होस्ट वेक्टर सिस्टम

उच्च सजीवों के जीनोम विश्लेषण के लिए बहुत बड़े टुकड़ों का क्लोनिंग आवश्यक होता है। क्योंकि यूकैरियोटिक जीनों में इंट्रॉन होते हैं जो सैकड़ों किलोबेस लंबे हो सकते हैं और यदि इंट्रॉन रहित यूकैरियोटिक जीन को भी सम्मिलित करना हो, तो भी उसका आकार प्लाज्मिड के लिए अधिकतम सम्मिलित टुकड़े की सीमा से अधिक होता है। इसलिए ऐसे बड़े डीएनए टुकड़ों के लिए विशेष वेक्टरों की आवश्यकता होती है। परिणामस्वरूप, विशाल यूकैरियोटिक डीएनए को वहन करने के लिए ‘कृत्रिम गुणसूत्र’ विकसित किए गए हैं।

यूकैरियोटिक होस्ट वेक्टर प्रणाली में सबसे सामान्य बेकर’s यीस्ट, सैकरोमाइसीज़ सिरेविसिया है। यद्यपि यीस्ट यौन रूप से प्रजनन कर सकता है, पर कोशिकाएँ सामान्यतः कलिका द्वारा अलैंगिक रूप से गुणित होती हैं। वे निलंबन में एकल कोशिकाओं के रूप में वृद्धि करती हैं और ठोस माध्यम में कॉलोनियाँ बनाती हैं, जैसे ई. कोलाई में। चयापचय, जैवसंश्लेषण और कोशिका चक्र दोषपूर्ण उत्परिवर्तित जीवों का एक बड़ा संग्रह ज्ञात है और आनुवंशिक रूप से मानचित्रित है। खाद्य उद्योग में $S$. cerevisiae के सुरक्षित उपयोग की लंबी परंपरा के कारण, यह सामान्यतः सुरक्षित माने जाने वाले (GRAS) जीवों की श्रेणी में आता है।

S. cerevisiae में एक द्वि-सूत्रीय वृत्ताकार प्लाज्मिड भी पाया जाता है जिसे $2 \mu \mathrm{m}$ प्लाज्मिड कहा जाता है, जिसका उपयोग कई वेक्टर विकसित करने के लिए किया गया है। वेक्टरों का एक महत्वपूर्ण वर्ग जो बड़े आकार के डीएनए सम्मिलन (200-500 kb आकार) के लिए डिज़ाइन किया गया है, यीस्ट कृत्रिक गुणसूत्र (YACs) के रूप में जाना जाता है। YAC वेक्टर में यीस्ट टेलोमेरिक अनुक्रम की दो प्रतियाँ होती हैं (टेलोमियर गुणसूत्रों के सिरों पर स्थित अनुक्रम होते हैं), एक यीस्ट सेंट्रोमेरिक अनुक्रम, एक यीस्ट ARS (एक स्वतः प्रतिकृतिकरण अनुक्रम जहाँ डीएनए प्रतिकृतिकरण प्रारंभ होता है), और उपयुक्त चयन योग्य मार्कर होते हैं। YAC दो रूपों में होता है, एक वृत्ताकार रूप जो बैक्टीरिया में वृद्धि के लिए होता है, और एक रेखीय रूप जो यीस्ट में वृद्धि के लिए होता है (चित्र 2.13)। वृत्ताकार रूप को बैक्टीरिया में किसी अन्य प्लाज्मिड की तरह संचालित और विकसित किया जा सकता है क्योंकि इसमें बैक्टीरियल प्रतिकृतिकरण मूल और एक एंटीबायोटिक प्रतिरोधी जीन होती है। इसे यीस्ट में उपयोग करने के लिए, वृत्ताकार रूप को अलग किया जाता है और रेखीय बनाया जाता है ताकि यीस्ट टेलोमियर अनुक्रम प्रत्येक सिरे पर हों।

चित्र 2.13: यीस्ट कृत्रिक गुणसूत्र (YAC)

YACs जैसे वेक्टर्स को कभी-कभी उच्च क्षमता वाले क्लोनिंग वेक्टर्स कहा जाता है। बैक्टीरियल प्लाज्मिड और फेज से आने वाले कुछ अन्य उच्च क्षमता वाले क्लोनिंग वेक्टर्स को बैक्टीरियल आर्टिफिशियल क्रोमोसोम्स (BACs) और फेज आर्टिफिशियल क्रोमोसोम्स (PACs) कहा जाता है।

जीन क्लोनिंग के लिए प्रयोग में लाए जाने वाले विभिन्न क्षमताओं वाले सामान्यतः प्रयुक्त वेक्टर्स की एक सूची टेबल 2.2 में दिखाई गई है।

टेबल 2.2: विभिन्न क्लोनिंग वेक्टर्स के साथ डीएनए सम्मिलित आकार

क्र. सं.	वेक्टर्स	सम्मिलित आकार (kb)
1.	प्लाज्मिड	$\leq 10 \mathrm{~kb}$
2.	बैक्टीरियोफेज	$8-25 \mathrm{~kb}$
3.	कॉस्मिड्स	$23-40 \mathrm{~kb}$
4.	PAC	$100-300 \mathrm{~kb}$
5.	BAC	$\leq 300 \mathrm{~kb}$
6.	YAC	$200-500 \mathrm{~kb}$

2.5 एक्सप्रेशन वेक्टर्स

अब तक हमने विभिन्न प्रकार के क्लोनिंग वेक्टरों की चर्चा की है जो डीएनए को प्रचारित करने के लिए प्रयोग किए जाते हैं। एक अन्य प्रकार के वेक्टर अभिव्यक्ति वेक्टर होते हैं जो डीएनए सम्मिलन के वाहन का कार्य करते हैं और साथ ही डीएनए सम्मिलन (जीन) को कुशलता से अभिव्यक्त होने देते हैं (चित्र 2.14)। ये प्लाज्मिड या वायरस आधारित वेक्टर हो सकते हैं। इन वेक्टरों में क्लोन किए गए जीनों की अभिव्यक्ति के लिए एक कुशल प्रमोटर होता है। ये प्रमोटर सामान्यतः प्रेरणीय प्रकृति के होते हैं ताकि क्लोन किए गए जीन की अभिव्यक्ति को नियंत्रित किया जा सके। प्रमोटर के डाउनस्ट्रीम में अभिव्यक्त होने वाले जीन को सम्मिलित करने के लिए अद्वितीय प्रतिबंधन स्थल होते हैं। इसके अतिरिक्त, क्लोन किए गए जीन के ट्रांसक्रिप्शन के समापन को सुनिश्चित करने के लिए वेक्टर द्वारा जीन के 3’ सिरे के निकट एक उचित ट्रांसक्रिप्शन समाप्ति अनुक्रम प्रदान किया जाता है। इस प्रकार, क्लोन किया गया जीन एक अभिव्यक्ति वेक्टर में 5’ सिरे (अपस्ट्रीम) की ओर एक प्रमोटर और 3’ सिरे (डाउनस्ट्रीम) पर एक टर्मिनेटर के बीच सम्मिलित किया जाता है। वेक्टर का यह भाग अभिव्यक्ति कैसेट कहलाता है। इसलिए ऐसे वेक्टर कभी-कभी सैंडविच अभिव्यक्ति वेक्टर भी कहे जाते हैं।

चित्र 2.14: एक अभिव्यक्ति वेक्टर

पुनर्संयोजी रणनीतियों द्वारा एक जीन की अभिव्यक्ति उस जीन के स्रोत के साथ-साथ प्रयोग किए जा रहे मेज़बान पर भी निर्भर करती है। इस प्रकार, उदाहरण के लिए, यदि किसी यूकैरियोटिक मूल के जीन को प्रोकैरियोटिक मेज़बान में अभिव्यक्त किया जाना है (या इसके विपरीत), जिसे विषमलॉग जीन अभिव्यक्ति कहा जाता है, क्योंकि अभिव्यक्त हो रहा जीन मेज़बान के लिए विदेशी है। ऐसी विषमलॉग अभिव्यक्ति के लिए आवश्यक है कि अभिव्यक्त हो रहा यूकैरियोटिक जीन: (i) इंट्रॉन नहीं रखता हो, क्योंकि प्रोकैरियोटिक मेज़बान में स्प्लाइसिंग की प्रक्रिया अनुपस्थित होती है, (ii) अभिव्यक्त प्रोटीन अपनी जैविक गतिविधि (कार्यक्षमता) के लिए अनुवादोत्तर संशोधन (जैसे ग्लाइकोसिलेशन) की आवश्यकता नहीं रखता हो।

2.6 शटल वेक्टर

वे वेक्टर जो दो वैकल्पिक मेज़बानों (या तो प्रोकैरियोटिक या यूकैरियोटिक) में प्रतिकृतिकरण के लिए विकसित किए गए हैं, शटल वेक्टर कहलाते हैं। ये वेक्टर स्वयं पुनर्संयोजी डीएनए तकनीकों द्वारा निर्मित किए गए हैं, और कई विभिन्न प्रकार के बनाए गए हैं। कुछ वे दो प्रोकैरियोटिक प्रजातियों के बीच शटल करते हैं, अन्य एक प्रोकैरियोट (आमतौर पर $E$. coli) और यूकैरियोटिक कोशिकाओं (जिनमें यीस्ट, पौधे और जानवर शामिल हैं) के बीच। वास्तव में, अधिकांश यूकैरियोटिक वेक्टर शटल होते हैं। शटल वेक्टरों में प्रतिकृतिकरण के दो मूल होते हैं, हालांकि, किसी दिए गए मेज़बान में एक समय पर केवल एक मूल सक्रिय होता है (चित्र 2.15)।

चित्र 2.15: $E$. coli और यीस्ट के लिए शटल वेक्टर

सारांश

• rDNA प्रौद्योगिकी एक दो-घटक प्रणाली है: एक संगत मेज़बान और वेक्टर संयोजन, जहाँ वेक्टर एक संगत मेज़बान में अपनी प्रतिकृति के लिए आवश्यक अनिवार्य अनुक्रम प्रदान करता है जो विभिन्न प्रतिकृति कार्य प्रदान करता है।
• क्लोनिंग वेक्टर का आकार छोटा होना चाहिए और इसमें प्रतिकृति का मूल या ori स्थल, अद्वितीय प्रतिबंध स्थल और चयन योग्य चिह्न होना चाहिए।
• प्लाज़्मिड वृत्ताकार, गुणसूत्र-बाह्य द्वि-श्रृंखला DNA (dsDNA) होते हैं जो स्वायत्त प्रतिकृति में सक्षम होते हैं।
• बैक्टीरियोफेज लैम्बडा $(\lambda)$ और M13 दो सबसे सामान्य फेज हैं जिनके जीनोम का उपयोग प्रायः $E$. coli मेज़बान के लिए क्लोनिंग वेक्टर बनाने में किया गया है।
• बैक्टीरियोफेज लैम्बडा, एक जीवाणु वायरस जो $E$. coli को संक्रमित करता है, को व्यापक रूप से क्लोनिंग वेक्टर के रूप में उपयोग किया गया है।
• लैम्बडा जीनोम से निकलने वाले विशिष्ट वेक्टर दो व्यापक श्रेणियों में आते हैं, अर्थात् ‘सम्मिलन वेक्टर’ और ‘प्रतिस्थापन वेक्टर’।
• M13 $E$. coli का एक तंत्वाकार बैक्टीरियोफेज है जिसका जीनोम $6.4 \mathrm{~kb}$ लंबे वृत्ताकार DNA का होता है जो एक नलिकाभी आवरण में संकुलित होता है।
• E. coli के लिए M13 आधारित वेक्टर का एक उदाहरण M13mp18 है जो पुनःसंयोजकों की नीली/सफेद चयन सुविधा प्रदान करता है।
• कॉस्मिड एक प्रकार का संकर (संयोजन) वेक्टर है जो प्लाज़्मिड की तरह प्रतिकृति करता है लेकिन इसे इन विट्रो में लैम्ब्डा फेज कोट में संकुलित किया जा सकता है।
• एक विशिष्ट कॉस्मिड में प्रतिकृति कार्य, अद्वितीय प्रतिबंध एंडोन्यूक्लिएस स्थल और चयनात्मक चिह्न होते हैं जो प्लाज़्मिड DNA द्वारा योगदान किए जाते हैं, लैम्ब्डा DNA खंड के साथ संयुक्त जिसमें संयुक्त सुसंगत सिरे (cos स्थल) शामिल हैं।
• फाज़्मिड फेज और प्लाज़्मिड के बीच सच्चे संयोजन वेक्टर हैं। ये रेखीय द्वि-श्रृंखला DNAs होते हैं जिनके सिरे लैम्ब्डा खंड होते हैं जिनमें लिटिक संक्रमण के लिए आवश्यक सभी जीन होते हैं और मध्य खंड रेखीय प्लाज़्मिड होता है।
• यूकैरियोटिक मेज़बान वेक्टर प्रणाली में सबसे सामान्य बेकर’s यीस्ट, Saccharomyces cerevisiae है, जिससे YAC’s जेनेटिक इंजीनियरिंग के माध्यम से व्युत्पन्न किए गए हैं।
• एक YAC क्लोनिंग वेक्टर में यीस्ट टेलोमेरिक अनुक्रम की दो प्रतियाँ (टेलोमियर गुणसूत्रों के सिरों पर स्थित अनुक्रम होते हैं), एक यीस्ट सेन्ट्रोमेरिक अनुक्रम, एक यीस्ट ARS (एक स्वतः प्रतिकृति अनुक्रम) और उपयुक्त चयन योग्य चिह्न होते हैं।

अभ्यास

1. rDNA प्रौद्योगिकी में होस्ट वेक्टर प्रणाली के महत्व का वर्णन कीजिए।

2. एक वेक्टर की प्रमुख विशेषताएँ क्या हैं?

3. प्लाज्मिड क्या है और इसके विभिन्न प्रकार कौन-से हैं?

4. (pBR322) प्लाज्मिड क्लोनिंग वेक्टरों के विकास के लिए अपनाई गई रणनीति की चर्चा कीजिए।

5. लैम्ब्डा बैक्टीरियोफेज की संरचना का संक्षेप में वर्णन कीजिए और साथ ही लैम्ब्डा फेज आधारित वेक्टरों की भूमिका पर चर्चा कीजिए।

6. M13 आधारित वेक्टरों और उनके अनुप्रयोग पर चर्चा कीजिए।

7. कॉस्मिड और फेजमिड के बीच अंतर कीजिए।

8. जीन के क्लोनिंग के लिए वेक्टर की आवश्यकता क्यों होती है?

9. एक प्लाज्मिड जो होस्ट गुणसूत्र में समाकलित हो सकता है, उसे कहा जाता है:

(a) Col प्लाज्मिड

(b) एपिसोम

(c) Ti प्लाज्मिड

(d) R प्लाज्मिड

10. सिंगल कॉपी प्लाज्मिड की प्रतिकृति को सख्त प्रतिकृति क्यों कहा जाता है?

11. निम्नलिखित में से गलत मिलान युग्म की पहचान कीजिए:

(i) मल्टी कॉपी प्लाज्मिड

(ii) Col प्लाज्मिड

(iii) pBR322

(iv) प्रोफेज

(a) सख्त प्रतिकृति

(b) जीवाणुओं को मारता है

(c) प्लाज्मिड

(d) फेज जीनोम जो होस्ट जीनोम में सम्मिलित होता है

12. एक बड़े आकार के यूकेरियोटिक जीन सम्मिलन को क्लोन कैसे किया जा सकता है?

13. अभिकथन: एक आदर्श वेक्टर में चयन योग्य चिह्न होना चाहिए।

कारण: ट्रांसफॉर्मेशन को छाँटने के लिए चयन योग्य चिह्न आवश्यक होते हैं।

(a) अभिकथन और कारण दोनों सत्य हैं और कारण अभिकथन का सही स्पष्टीकरण है।

(b) अभिकथन और कारण दोनों सत्य हैं लेकिन कारण अभिकथन का सही स्पष्टीकरण नहीं है।

(c) अभिकथन सत्य है लेकिन कारण असत्य है।

(d) दोनों कथन और कारण गलत हैं।

14. कथन: कॉस्मिड एक संकर सदिश है।

कारण: कॉस्मिड में प्लाज्मिड्स और लैम्ब्डा फेज सदिश दोनों के गुण होते हैं।

(a) दोनों कथन और कारण सही हैं और कारण कथन का सही स्पष्टीकरण है।

(b) दोनों कथन और कारण सही हैं लेकिन कारण कथन का सही स्पष्टीकरण नहीं है।

(c) कथन सही है लेकिन कारण गलत है।

(d) दोनों कथन और कारण गलत हैं