जीन क्लोनिंग जैव प्रौद्योगिकी उद्योग और विभिन्न अन्य उद्देश्यों के लिए किसी जीन को उसके उत्पाद के रूप में उपयोग करने की एक सामान्य प्रक्रिया है। परंपरागत रूप से, यह रुचि के जीन को धारित करने वाले डीएनए खंड को एक वेक्टर द्वारा मेजबान कोशिका में स्थानांतरित करने की प्रक्रिया को शामिल करता है ताकि जीन की अनेक प्रतियां उसके विश्लेषण और भविष्य के अनुप्रयोग के लिए उपलब्ध हो सकें। आनुवंशिक इंजीनियरिंग के क्षेत्र में तकनीकी सफलता ने डीएनए का विश्लेषण करने, किसी जीनोम से विशिष्ट जीन को पृथक करने, एंजाइमेटिक रूप से उसे एक स्वतंत्र रूप से प्रतिकृत होने वाले वेक्टर (जैसे प्लाज्मिड) में सम्मिलित कर rDNA अणु उत्पन्न करने और अंततः उसे मेजबान (जैसे जीवाणु) में प्रस्तुत कर उसकी लगभग असीमित संख्या में प्रतियां (क्लोन) उत्पन्न करना संभव बना दिया है। यह अध्याय विद्यार्थियों को जीन क्लोनिंग में शामिल सभी प्रक्रियाओं से परिचित कराएगा।

3.1 उम्मीदवार जीन की पहचान

पिछले दशकों में, rDNA प्रौद्योगिकी का उपयोग ऐसी फसलों को उत्पन्न करने के लिए किया गया है जो कीटों, रोगों, हर्बिसाइडों और रोगजनकों के प्रति प्रतिरोधी हैं। यह किसी एक जीव के रुचि के विशिष्ट जीन में हेरफेर करके उसे दूसरे जीव के जीनोम में स्थानांतरित करने से संभव होता है, जिसके अभिव्यक्त होने पर वांछित उत्पाद या गतिविधि प्राप्त होती है। इस प्रक्रिया में पहली और सबसे कठिन समस्या किसी जीव के जीनोम में उम्मीदवार जीन की पहचान करना है।

किसी जीन को क्लोन करने के लिए उसकी पहचान इस बात पर निर्भर करती है कि वह जैव-चिकित्सीय, आर्थिक और विकासवादी क्षेत्रों में अपनी भूमिका के संदर्भ में कितना महत्वपूर्ण है। किसी जीन के बारे में यह जानकारी उसके जैव-रासायनिक और शारीरिक अध्ययनों से प्राप्त होती है। उदाहरण के लिए, रोगों का कारण (मानवों में इंसुलिन की कमी के कारण मधुमेह) या चयापचय मार्गों में दोष (पौधों में आयरन की कमी के कारण क्लोरोसिस) या पर्यावरण के प्रति प्रतिरोध (पौधों में लवणता सहिष्णुता) या संक्रमण के प्रति प्रतिरोध (पौधों और जानवरों दोनों में) या आर्थिक दृष्टि से महत्वपूर्ण जीन (दूध प्रोटीन, रक्त के थक्के बनाने वाले कारक आदि) मानव स्वास्थ्य और आवश्यकताओं में सुधार के लिए उम्मीदवार जीन होते हैं। एक बार जब कोई रुचिकर जीन पहचान लिया जाता है, तो उसे नए स्रोतों में खोजा जाता है और उसे आगे के अनुभागों में वर्णित अनुसार क्लोन किया जाता है।

किसी जीन की खोज करना आसान काम नहीं है। यह बात निम्नलिखित उदाहरण से स्पष्ट हो जाएगी। जैसा कि आप जानते हैं, एक हैप्लॉयड मानव जीनोम में लगभग 3.2 अरब bp होते हैं। इसलिए, 3000 से $3500 \mathrm{bp}$ आकार वाले किसी रुचिकर जीन की खोज करना, जो कि जीनोम का एक-लाखवां हिस्सा है; शायद घास के ढेर से सुई खोजने से भी अधिक कठिन है। हालांकि, यदि हमें किसी जीन के प्रोटीन उत्पाद की जानकारी हो, तो हम जेनेटिक कोड का उपयोग करके उसकी mRNA अनुक्रम तैयार कर सकते हैं, जिससे उसका DNA अनुक्रम निकाला जा सकता है या हम mRNA को प्रोब के रूप में उपयोग करके जीनोम लाइब्रेरी से जीन की खोज कर सकते हैं। हम उस ऊतक से जीन की mRNA को भी अलग कर सकते हैं जो उसे विशेष रूप से उत्पन्न करता है। mRNA से, हम रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज एंजाइम का उपयोग करके RNA:cDNA हाइब्रिड अणु तैयार कर सकते हैं। RNA:cDNA हाइब्रिड अणु से RNA स्ट्रैंड को RNase एंजाइम का उपयोग करके हटाया जा सकता है। एकल स्ट्रैंड cDNA को DNA पॉलिमरेज एंजाइम का उपयोग करके द्विस्ट्रैंड cDNA में बदला जाता है। उम्मीदवार जीन को फिर क्लोन किया जा सकता है, जिसकी चर्चा आगामी अध्यायों में की गई है।

3.2 न्यूक्लिक अम्लों का पृथक्करण

किसी भी आण्विक जीव विज्ञान प्रयोग की सबसे पहली और प्रमुख आवश्यकता जीवों से न्यूक्लिक अम्लों का पृथक्करण है। न्यूक्लिक अम्लों के निष्कर्षण को दो बड़ी चुनौतियों का सामना करना पड़ता है। पहली उनकी कोशिकाओं में उपलब्धता से संबंधित है क्योंकि डीएनए और आरएनए दोनों ही कोशिकाओं में अन्य जैविक बड़े अणुओं—जैसे प्रोटीन, कार्बोहाइड्रेट और लिपिड्स—की तुलना में बहुत कम मात्रा में मौजूद होते हैं। दूसरी, न्यूक्लिक अम्लों की विशाल लंबाई विशेष रूप से उन्हें कठोर भौतिक तनाव के संपर्क में आने पर विखंडन के प्रति संवेदनशील बनाती है। इसके अतिरिक्त, न्यूक्लिक अम्लों के विभिन्न घटकों को आपस में जोड़ने वाले रासायनिक बंध और उनमें उपस्थित विविध समूह न्यूक्लिक अम्ल को रासायनिक कारकों के प्रति भी संवेदनशील बनाते हैं।

न्यूक्लिक अम्लों के निष्कर्षण के दौरान चार महत्वपूर्ण चरण शामिल होते हैं। पहला चरण कोशिका झिल्ली या भित्तियों को प्रभावी रूप से भेद कर न्यूक्लिक अम्लों और अन्य कोशिकीय अणुओं को मुक्त करने से संबंधित होता है। दूसरा चरण न्यूक्लिक अम्लों को उनके संबंधित अपघटन एंजाइमों से सुरक्षा प्रदान करने से जुड़ा होता है, जो अन्य प्रोटीनों के साथ पृथक्करण माध्यम में मुक्त होते हैं। तीसरे चरण में न्यूक्लिक अम्लों को अन्य अणुओं से पृथक किया जाता है। चौथे और अंतिम चरण में पृथक किए गए न्यूक्लिक अम्लों को एथेनॉल या आइसोप्रोपानॉल डालकर अवक्षेपित और सांद्रित किया जाता है (चित्र 3.1)।

चित्र 3.1: न्यूक्लिक अम्ल के पृथक्करण में शामिल चरण

हालांकि, सभी जीवों में न्यूक्लिक अम्लों के रासायनिक और भौतिक गुण समान होते हैं, कोशिका की बाहरी सीमा एक जीव से दूसरे जीव में भिन्न होती है। इसलिए, न्यूक्लिक अम्लों को निष्कर्षण माध्यम में मुक्त करने के लिए कोशिका की सीमाओं को भंग करने के लिए विभिन्न रणनीतियाँ अपनाई जाती हैं। पशु कोशिकाओं में प्लाज्मा झिल्ली होती है जिसे आसानी से भंग किया जा सकता है। दूसरी ओर, पौधों की कोशिकाओं और जीवाणुओं को कठोर परतों (जैसे कोशिका भित्ति) द्वारा संरक्षित किया जाता है, जिनके लिए उनके विघटन के लिए विभिन्न दृष्टिकोणों की आवश्यकता होती है। इनमें समांगीकरण, पीसना, सोनिकेशन या एंजाइमैटिक उपचार शामिल हैं। ऐसा यांत्रिक या एंजाइमैटिक उपचार प्लाज्मा झिल्ली या कोशिका भित्ति को फाड़ देता है ताकि न्यूक्लिक अम्ल कोशिकाओं से मुक्त हो जाएँ और वे न्यूक्लिएस एंजाइमों (डीऑक्सीराइबोन्यूक्लिएस और राइबोन्यूक्लिएस) के प्रति उजागर हो जाएँ, जो एक साथ मुक्त होते हैं।

चूंकि जीवाणु कोशिकाओं में कोशिका भित्ति और कोशिका झिल्ली के अलावा बहुत कुछ संरचना नहीं होती है, उनसे डीएनए को अलग करना बहुत आसान होता है। लाइसोजाइम नामक एक एंजाइम पेप्टिडोग्लाइकन को पचाता है, जो जीवाणु कोशिका भित्ति का मुख्य घटक है। सोडियम डोडेसिल सल्फेट (SDS) जैसे डिटर्जेंट्स का उपयोग कोशिका झिल्ली को फाड़ने के लिए किया जाता है जो लिपिड द्विपरत को बाधित करते हैं। पौधों और जानवरों की कोशिकाओं को पीसकर अंतःकोशिकीय घटकों को मुक्त किया जाता है। पौधों की कोशिकाओं को ब्लेंडर में यांत्रिक रूप से चूर किया जाता है ताकि कठोर कोशिका भित्ति टूट जाए। पौधों की कोशिकाओं से डीएनए को अलग करने के लिए, सेटिल ट्राइमेथिल अमोनियम ब्रोमाइड (CTAB) को डिटर्जेंट के रूप में प्रयोग किया जाता है (एक धनायनिक डिटर्जेंट)। पौधों की कोशिकाओं में जानवरों की कोशिकाओं की तुलना में पॉलीसैकेराइड और पॉलीफेनोल की सांद्रता अधिक होती है और डीएनए को अलग करने में समस्या पैदा करते हैं। डीएनए और पॉलीसैकेराइड की CTAB में घुलनशीलता विलयन की आयनिक ताकत पर निर्भर करती है। कम आयनिक ताकत पर, डीएनए CTAB विलयन में घुलनशील होता है जबकि पॉलीसैकेराइड अघुलनशील होते हैं; जबकि उच्च आयनिक ताकत पर, पॉलीसैकेराइड घुलनशील होते हैं और डीएनए अघुलनशील होता है। इसके अतिरिक्त, एक डिटर्जेंट होने के नाते, यह कोशिका भित्ति को भी फाड़ता है। दोनों अणुओं को CTAB के प्रति उनके विभेदी आसक्ति के आधार पर अलग किया जाता है। पॉलीविनाइल पाइरोलिडोन (PVP) को CTAB निष्कर्षण माध्यम में मिलाने से फेनोल्स उदासीन हो जाते हैं। सुपरनेटेंट में मौजूद घुलनशील डीएनए को क्लोरोफॉर्म-आइसोएमिल विलयन से निष्कर्षित किया जाता है। जलीय चरण में मौजूद डीएनए को एथेनॉल या आइसोप्रोपेनॉल का उपयोग करके अवक्षेपित किया जाता है। जानवरों की कोशिकाओं के मामले में, कोशिका झिल्ली को डिटर्जेंट द्वारा बाधित किया जाता है ताकि अंतःकोशिकीय घटक मुक्त हो सकें।

जिन कोशिकाओं और ऊतकों से न्यूक्लिक अम्ल निकाले जाने हैं, उन्हें या तो यांत्रिक रूप से या एंजाइमेटिक रूप से एक माध्यम में तोड़ा जाता है। माध्यम सामान्यतः एक बफर होता है जिसमें हल्का क्षारीय $\mathrm{pH}$ होता है और न्यूनतम आयनिक सामर्थ्य $(0.05 \mathrm{M})$ होता है, जिसमें एक किलेटिंग एजेंट एथिलीन डाइअमीन टेट्राएसिटिक एसिड (EDTA) होता है। हल्का क्षारीय $\mathrm{pH}$ DNA और मूलभूत प्रोटीनों (हिस्टोन) के बीच विद्युत-आवेशीय अन्योन्यक्रिया को कम करने में सहायक होता है जो कोशिका विघटन के दौरान मुक्त होते हैं। द्विसंयुक्त धनायनों, विशेषकर $\mathrm{Mn}^{2+}$ और $\mathrm{Mg}^{2+}$ का किलेशन न्यूक्लिएसेज की क्रिया को रोकता है। आगे, बफर के क्षारीय $\mathrm{pH}$ के कारण उनकी गतिविधियों की निषेधन प्राप्त होता है। इसके अतिरिक्त, द्विसंयुक्त धनायनों का किलेशन न्यूक्लिक अम्लों के फॉस्फेट समूहों के साथ उनके संबंधित लवणों के निर्माण को रोकता है।

अगला चरण न्यूक्लिक अम्लों को उनसे जुड़े प्रोटीनों से अलग करना है। यह प्रोटीन और न्यूक्लिक अम्लों के बीच की अन्योन्यक्रिया को कम करके प्राप्त किया जाता है ताकि न्यूक्लिक अम्ल प्रोटीन से मुक्त हो जाएँ, जिसके लिए उन्हें डिटर्जेंट्स जैसे SDS, एक ऐनियोनिक डिटर्जेंट, के संपर्क में लाया जाता है। SDS के संपर्क में आने से सभी प्रोटीन अणु ऐनियोनिक बन जाते हैं। परिणामस्वरूप, बेसिक प्रोटीन जो धनात्मक आवेश रखते हैं और ऋणात्मक आवेश वाले न्यूक्लिक अम्लों से जुड़े होते हैं, ऋणात्मक आवेश प्राप्त कर न्यूक्लिक अम्लों से विलग हो जाते हैं। इसके अतिरिक्त, SDS न्यूक्लिएसों की गतिविधियों को भी रोकता है जिससे न्यूक्लिक अम्लों को न्यूक्लिएसों से अतिरिक्त सुरक्षा मिलती है। फिर माध्यम में उच्च सांद्रता में सोडियम क्लोराइड मिलाया जाता है। बढ़ी हुई लवण सांद्रता DNA और धनायनों के बीच की आयनिक अन्योन्यक्रिया को कम करती है जिससे DNA और प्रोटीन संकुलों का पूर्ण वियोजन सुनिश्चित होता है। माध्यम से प्रोटीन हटाना (डिप्रोटीनाइज़ेशन) क्लोरोफॉर्म और आइसोएमिल अल्कोहल के संपर्क में लाकर किया जाता है। ये विलायक अध्रुवीय प्रकृति के होते हैं। जब इन्हें ध्रुवीय प्रकृति के माध्यम में मिलाकर अपकेंद्रण (सेंट्रीफ्यूगेशन) किया जाता है, तो यह तीन स्पष्ट परतें देता है। चूँकि कार्बनिक विलायक मिश्रण का घनत्व पानी से अधिक होता है, यह निचली परत बनाता है (जिसमें विकृत प्रोटीन होते हैं) जबकि ऊपरी परत जलीय प्रकृति की होती है और इसमें न्यूक्लिक अम्ल होते हैं। क्लोरोफॉर्म प्रोटीनों को विकृत करता है जबकि आइसोएमिल अल्कोहल झाग बनने को रोकता है और निचली कार्बनिक और ऊपरी जलीय चरण के बीच इंटरफेस को स्थिर करने में मदद करता है, जिसे पिपेटिंग द्वारा अलग किया जा सकता है। जलीय चरण से न्यूक्लिक अम्लों को अलग करने के लिए जलीय माध्यम में एथेनॉल मिलाया जाता है जिससे इसकी ध्रुवीयता कम हो जाती है, जिससे जलीय माध्यम अध्रुवीय बन जाता है और इस प्रकार न्यूक्लिक अम्ल अघुलनशील हो जाते हैं जो पहले जलीय माध्यम में घुलनशील थे। RNA को हटाने के लिए एंज़ाइम राइबोन्यूक्लिएस A मिलाया जाता है जो RNA को राइबोन्यूक्लियोटाइड्स में पचा देता है। फिर DNA को अपकेंद्रण द्वारा अलग किया जाता है और निम्न तापमान पर संग्रहित किया जाता है।

RNA अलगाव

RNA एकल सूत्री होता है, जबकि DNA अधिकतर द्विसूत्री होता है। राइबोन्यूक्लिएसेज़ (RNases), एंजाइमों का एक समूह जो RNA अणुओं को अपघटित करता है, पर्यावरण में प्रचुर मात्रा में होते हैं और इन्हें पूरी तरह से हटाना या नष्ट करना कठिन होता है। इस प्रकार, अक्सर अखंड RNA को अलग करना कठिन होता है।

चित्र 3.2: (a) RNA अलगाव के लिए प्रवाह चार्ट

कुल RNA जैविक नमूनों से ग्वानिडिनियम आइसोथायोसायनेट (GITC)–फ़िनॉल–क्लोरोफ़ॉर्म नामक विशिष्ट अभिकर्मक का उपयोग करके निष्कर्षित किया जाता है। GITC एक कायोट्रॉपिक अभिकर्मक है और अम्लीय प्रकृति का है क्योंकि यह हाइड्रोजन बंध को विघटित करता है और एन्ट्रॉपी (अराजकता) बढ़ाने के लिए ऊर्जा मुक्त करता है जिससे विलयन की हाइड्रोफोबिक प्रभाव घटता है जिसके परिणामस्वरूप प्रोटीन और न्यूक्लिक अम्ल एकत्रित हो जाते हैं। फ़िनॉल प्रोटीनों को डिनेचर करता है जबकि क्लोरोफ़ॉर्म लिपिड्स को घोलता है। क्लोरोफ़ॉर्म पानी के सापेक्ष फ़िनॉल के विशिष्ट भार को भी बढ़ाता है। जब जैविक नमूनों को GITC विलयन के साथ उपचारित किया जाता है और सेंट्रीफ्यूगेशन के अधीन किया जाता है, तो विलयन तीन चरणों में विभाजित हो जाता है: ऊपरी जलीय चरण, इंटरफेस और कार्बनिक चरण। कुल RNA जलीय चरण में निष्कर्षित होता है क्योंकि अभिकर्मक अम्लीय प्रकृति का होता है जबकि DNA और डिनेचर प्रोटीन इंटरफेस या कार्बनिक चरण में रहते हैं। यह चरण RNase एंजाइम को भी निष्क्रिय करता है जो RNA को हाइड्रोलाइज़ कर सकता है। तत्पश्चात, जलीय चरण से RNA आइसोप्रोपेनॉल की सहायता से अवक्षेपित किया जाता है (चित्र 3.2 (a) और b)।

चित्र 3.2: (b) RNA निष्कर्षण

बॉक्स 1: प्लाज्मिड डीएनए को जीनोमिक डीएनए से पृथक्करण

क्लोनिंग प्रयोगों में दो प्रकार की डीएनए अणुओं का पृथक्करण किया जाता है। एक प्लाज्मिड डीएनए है और दूसरा बैक्टीरिया का जीनोमिक डीएनए है। क्रोमोसोमल डीएनए को प्लाज्मिड डीएनए से बैक्टीरियल लाइसेट को उबालकर पृथक किया जाता है। लाइसेट को उबालने से क्रोमोसोमल डीएनए का अपरिवर्तनीय विकृतिकरण होता है और प्रोटीनों सहित डिऑक्सीराइबोन्यूक्लिएस का भी विकृतिकरण होता है। उबालने से एक जेल बनता है, जिसे अपकेंद्रण द्वारा अवक्षेपित किया जाता है। दूसरी ओर, आंशिक रूप से विकृत हुआ प्लाज्मिड डीएनए (उबालने के कारण) वृत्ताकार डबल हेलिक्स के रूप में पुनःप्राकृत हो जाता है और विलेय बन जाता है। एक अन्य विधि में, बैक्टीरियल निलंबन को लाइस किया जाता है और इसकी सामग्री को ऐनियोनिक डिटर्जेंट एसडीएस और $\mathrm{NaOH}$ विलयन द्वारा विकृत किया जाता है। टूटी हुई कोशिका भित्ति, क्रोमोसोमल डीएनए और विकृत प्रोटीन एसडीएस से लेपित एक बड़े द्रव्य के रूप में गुच्छित हो जाते हैं जो सोडियम आयनों $(\mathrm{Na}+)$ को पोटैशियम आयनों $(\mathrm{K}+)$ से प्रतिस्थापित करके विलयन से अवक्षेपित हो जाते हैं। अवक्षेप को फिर अपकेंद्रण द्वारा पृथक किया जाता है। प्लाज्मिड डीएनए को सुपरनेटेंट से एथेनॉल अवक्षेपण द्वारा पृथक किया जाता है।

3.3 पुनःसंयोजक डीएनए प्रौद्योगिकी के लिए उपयोग किए जाने वाले एंजाइम

एंजाइम rDNA प्रौद्योगिकी में एक महत्वपूर्ण उपकरण का निर्माण करते हैं। डीएनए के हेरफेर का प्रमुख कार्य वेक्टर डीएनए और रुचिकर जीन की कटिंग और लिगेशन को सम्मिलित करता है। इसके लिए, जीवों में पाए जाने वाले विभिन्न एंजाइमों की प्राकृतिक क्षमताओं का उपयोग किया जाता है। rDNA प्रौद्योगिकी में प्रयुक्त प्रमुख एंजाइम हैं:

(i) न्यूक्लिएसेज़: न्यूक्लिएसेज़ वे एंजाइम होते हैं जो न्यूक्लिक अम्लों को विभाजित करते हैं, यह उन फॉस्फोडाइएस्टर बॉन्ड्स को हाइड्रोलाइज़ करके करते हैं जो आसन्न न्यूक्लिओटाइड्स की शुगर इकाइयों को जोड़ते हैं। कुछ न्यूक्लिएसेज़ डीएनए-विशिष्ट होते हैं जिन्हें डीएनएज़ कहा जाता है और कुछ आरएनए-विशिष्ट होते हैं जिन्हें आरएनएज़ कहा जाता है। न्यूक्लिएसेज़ एंजाइमों के दो प्रमुख प्रकार होते हैं, जो यह इस बात पर निर्भर करते हैं कि वे पॉलिन्यूक्लिओटाइड श्रृंखला (डीएनए या आरएनए या सिंथेटिक पॉलिन्यूक्लिओटाइड श्रृंखला) के फॉस्फोडाइएस्टर बॉन्ड्स की किस स्थिति को प्राथमिकता देते हैं, अर्थात् एक्जोन्यूक्लिएस और एंडोन्यूक्लिएस। एक्जोन्यूक्लिएस, जैसा कि नाम से स्पष्ट है, पॉलिन्यूक्लिओटाइड श्रृंखलाओं के $3^{\prime}$ या $5^{\prime}$ सिरों से एक-एक करके न्यूक्लिओटाइड्स को हटाता है, अर्थात् मोनोन्यूक्लिओटाइड्स। दूसरी ओर, एंडोन्यूक्लिएस डीएनए या आरएनए अणु के भीतर आंतरिक फॉस्फोडाइएस्टर बॉन्ड्स को तोड़ता है [चित्र 3.3 (a) और (b)]।

चित्र 3.3: (a) एक एक्जोन्यूक्लिएस, जो डीएनए अणु के सिरे से न्यूक्लिओटाइड्स को हटाता है

(b) एक एंडोन्यूक्लिएस, जो आंतरिक फॉस्फोडाइएस्टर बॉन्ड्स को तोड़ता है

(ii) प्रतिबंधक एंडोन्यूक्लिएस/एंजाइम (RE):

एंडोन्यूक्लिएस एंजाइम जो डीएनए अणुओं को एक विशिष्ट स्थान पर विभाजित करते हैं, उन्हें प्रतिबंधक एंडोन्यूक्लिएस या प्रतिबंधक एंजाइम कहा जाता है। ये ज्यादातर बैक्टीरिया और आर्किया में पाए जाते हैं जो आक्रमणकारी बैक्टीरियोफेज़ के खिलाफ रक्षा तंत्र प्रदान करते हैं। RE एक विशिष्ट डीएनए अनुक्रम को पहचानता है और उससे बंधन करता है जिसे पहचान अनुक्रम या स्थल कहा जाता है, जिसमें अक्सर 4 से $8 \mathrm{bp}$ होते हैं।

प्रतिबंधन एंजाइमों को मुख्यतः तीन समूहों (प्रकार I, II और III) में वर्गीकृत किया जाता है, जो उनके सह-कारक की आवश्यकता और DNA काटने वाले स्थान की लक्ष्य अनुक्रम से दूरी के आधार पर होता है। प्रकार I एंजाइम DNA को लगभग $1000 \mathrm{bp}$ दूर अपने पहचान स्थल से काटते हैं और इन्हें $\mathrm{S}$-एडेनोसिल मेथायोनिन (SAM), $\mathrm{Mg}^{2+}$, ATP की आवश्यकता होती है तथा इनमें DNA स्ट्रैंड क्लीवेज, मेथिलेज और ATPase गतिविधियाँ होती हैं। प्रकार II एंजाइम पहचान स्थल के भीतर ही DNA को काटते हैं और इन्हें केवल $\mathrm{Mg}^{2+}$ की आवश्यकता होती है तथा इनमें केवल DNA स्ट्रैंड क्लीवेज गतिविधि होती है (चित्र 3.4)। प्रकार II RE का उपयोग rDNA प्रौद्योगिकी में किया जाता है। प्रकार III एंजाइम पहचान स्थल से लगभग 24 से 26 bp दूर DNA को काटते हैं; इन्हें S-एडेनोसिल मेथायोनिन (SAM), $\mathrm{Mg}^{2+}$, ATP की आवश्यकता होती है और इनमें DNA स्ट्रैंड क्लीवेज और मेथिलेज गतिविधियाँ होती हैं (तालिका 3.1)।

बॉक्स 2

1978 का नोबेल पुरस्कार चिकित्सा शास्त्र या शरीर क्रिया विज्ञान में वर्नर अर्बर, डैनियल नाथन्स और हैमिल्टन स्मिथ को संयुक्त रूप से ‘प्रतिबंधन एंजाइमों’ की खोज और उनके अनुप्रयोग को आण्विक आनुवंशिकी की समस्याओं में देने के लिए प्रदान किया गया। HindII पहला प्रतिबंधन एंजाइम था जिसे हैमिल्टन स्मिथ ने पृथक किया था।

तालिका 3.1: प्रतिबंधन एंजाइमों के प्रकार

	क्लीवेज साइट	एंडोन्यूक्लिएस और मेथिलेज़ कार्य	उदाहरण
प्रकार I	पहचान स्थल से लगभग 1000 bp दूर यादृच्छिक	एंडोन्यूक्लिएस और मेथिलेज़ दोनों एक ही प्रोटीन अणु पर कार्य करते हैं	EcoKI EcoAI CfrAI
प्रकार II	पहचान स्थल के भीतर विशिष्ट	एंडोन्यूक्लिएस और मेथिलेज़ अलग-अलग इकाइयाँ होती हैं	EcoRI BamHI HindIII
प्रकार III	पहचान स्थल से 24-26 आधार युग्म दूर यादृच्छिक और मेथिलेज़	एंडोन्यूक्लिएस और मेथिलेज़ दोनों एक ही प्रोटीन अणु पर कार्य करते हैं	EcoPI HinfIII EcoP15I

व्यापक रूप से प्रयुक्त प्रकार II REs की पहचान अनुक्रम पैलिन्ड्रोमिक अनुक्रम होते हैं, जिसका अर्थ है कि द्विगुणित DNA पर अग्र दिशा में अनुक्रम उसी तरह पढ़ा जाता है जैसे पूरक स्ट्रैंड पर विपरीत दिशा में। ये एंजाइम DNA अणु के दोनों स्ट्रैंडों में विशिष्ट फॉस्फोडाइएस्टर बंध को उस प्रतिबंधन अनुक्रम के भीतर या उस स्थल पर या उसके निकट तोड़ते हैं जिसे एंजाइम पहचानता है। यह कटाव के एक सिरे पर 5’-फॉस्फेट समूह और दूसरे सिरे पर 3’-हाइड्रॉक्सिल समूह उत्पन्न करता है (चित्र 3.4)। कई REs दोनों DNA स्ट्रैंडों पर विभिन्न स्थानों पर काट कर छोटे एकल-स्ट्रैंड प्रोट्रूडिंग सिरों वाले स्टैगर्ड कट उत्पन्न करते हैं जिन्हें कोहेसिव या स्टिकी सिरे कहा जाता है। कुछ REs दोनों स्ट्रैंडों को एक ही स्थान पर काट कर ब्लंट एंडेड कट उत्पन्न करते हैं (चित्र 3.4)।

चित्र 3.4: टाइप II REs चिपचिपे या सम कोण उत्पन्न करते हैं

आइए अब प्रतिबंधक एंजाइमों के नामकरण को समझें। एंजाइम का नाम उस सूक्ष्मजीव के नाम पर रखा जाता है जिससे इसे अलग किया जाता है। पहला बड़ा अक्षर वंश का प्रतिनिधित्व करता है, दूसरा और तीसरा अक्षर प्रजाति को दर्शाते हैं। चौथा अक्षर सूक्ष्मजीव के स्ट्रेन को निर्दिष्ट करता है। और अंतिम रोमन संख्या उस प्रजाति से अलग किए गए एंजाइम की संख्या को दर्शाती है (तालिका 3.2)।

तालिका 3.2: प्रतिबंधक एंडोन्यूक्लिएसेज़ के लिए नामकरण

EcoRI
Escherichia (E)	वंश
coli (co)	विशिष्ट उपनाम
स्ट्रेन Ry13 (R)	स्ट्रेन
पहला एंडोन्यूक्लिएस (I)	पहचान का क्रम

HindIII
Haemophilus (H)	वंश
influenzae (in)	विशिष्ट उपनाम
स्ट्रेन Rd (d)	स्ट्रेन
तीसरा एंडोन्यूक्लिएस (III)	पहचान का क्रम

(iii) DNA लिगेज: लिगेज एंजाइम डुप्लेक्स रूप में फॉस्फोडाइएस्टर बॉन्ड के निर्माण को उत्प्रेरित करके DNA स्ट्रैंड्स को आपस में जोड़ने में सहायता करता है (चित्र 3.5)। E. coli से प्राप्त जीवाणु DNA लिगेज NAD के जलअपघटन को अपनी ऊर्जा स्रोत के रूप में उपयोग करते हैं, जबकि बैक्टीरियोफेज (जैसे T4) और यूकैरियोटिक कोशिकाओं से प्राप्त DNA लिगेज ATP को ऊर्जा स्रोत के रूप में उपयोग करते हैं। एक चेन का 5’-P समूह पास की चेन के 3’$\mathrm{OH}$ समूह के सा�ह कोवैलेंट लिंकेज बनाता है। T4 DNA लिगेज का उपयोग कोहेसिव एंड्स या ब्लंट एंड्स वाले दो DNA अणुओं को जोड़ने के लिए किया जाता है। E. coli DNA लिगेज का उपयोग DNA अणुओं की एक स्ट्रैंड में दो न्यूक्लियोटाइड्स के बीच की गैप को जोड़ने के लिए किया जाता है।

चित्र 3.5: लिगेज द्वारा DNA का लाइगेशन (a) फॉस्फोडाइएस्टर बॉन्ड का निर्माण (b) स्टिकी एंड का लाइगेशन (c) ब्लंट एंड का लाइगेशन

(iv) DNA पॉलिमरेज़: DNA पॉलिमरेज़ एक ऐसे पॉलिमरेज़ समूह हैं जो टेम्पलेट स्ट्रैंड पर मोनो-डीऑक्सीराइबोन्यूक्लियोसाइड ट्राइफॉस्फेट्स (dNTPs) का उपयोग करके नए DNA स्ट्रैंड के संश्लेषण को उत्प्रेरित करते हैं। एक DNA पॉलिमरेज़ एंजाइम नए DNA स्ट्रैंड का संश्लेषण $5^{\prime} \rightarrow 3^{\prime}$ दिशा में करता है (चित्र 3.6)। यह नए DNA स्ट्रैंड के संश्लेषण की शुरुआत नहीं कर सकता। dNTPs के अलावा, इन्हें एक प्राइमर (ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड) की आवश्यकता होती है जिसमें एक मुक्त 3’-अंत हाइड्रॉक्सिल समूह होता है जिसे श्रृंखला वृद्धि के प्रारंभिक बिंदु के रूप में उपयोग किया जा सकता है। E. coli का DNA पॉलिमरेज़ I कई अन्य गतिविधियाँ प्रदर्शित करता है, जैसे $5^{\prime} \rightarrow 3^{\prime}$ एक्सोन्यूक्लिएस और $3^{\prime} \rightarrow 5^{\prime}$-एक्सोन्यूक्लिएस।

चित्र 3.6: DNA पॉलिमरेज़ DNA अणु के 3’OH अंत पर न्यूक्लियोटाइड जोड़ता है

(v) क्षारीय फॉस्फेटेज: क्षारीय फॉस्फेटेज का उपयोग DNA स्ट्रैंड्स के 5’ अंत से टर्मिनल फॉस्फेट समूह को हटाने के लिए किया जाता है।

(vi) पॉलिन्यूक्लियोटाइड काइनेज: पॉलिन्यूक्लियोटाइड काइनेज का उपयोग करके, DNA के $5^{\prime}$ अंत पर मौजूद हाइड्रॉक्सिल (-OH) समूह से एक फॉस्फेट समूह जोड़ा जा सकता है। पॉलिन्यूक्लियोटाइड काइनेज का प्रभाव क्षारीय फॉस्फेटेज के विपरीत होता है, यह मुक्त $5^{\prime}$ टर्मिनी पर फॉस्फेट समूह जोड़ता है।

(vii) टर्मिनल डिऑक्सीन्यूक्लिओटिडिल ट्रांसफ़ेरेस या टर्मिनल ट्रांसफ़ेरेस: यह एंजाइम डीएनए स्ट्रैंड के 3’ सिरे पर समान न्यूक्लिओटाइड अवशेषों को जोड़कर एक समबहुलिमर पूंछ बना सकता है। अधिकांश डीएनए पॉलिमरेज़ों के विपरीत, इसे टेम्पलेट की आवश्यकता नहीं होती।

(viii) रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज़: इसे आरएनए निर्देशित डीएनए पॉलिमरेज़ भी कहा जाता है और यह कई रेट्रोवायरसों में पाया जाता है। इसका उपयोग आरएनए टेम्पलेट से पूरक डीएनए (cDNA) स्ट्रैंड उत्पन्न करने के लिए किया जाता है, जिस प्रक्रिया को रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन कहा जाता है (चित्र 3.7)।

चित्र 3.7: रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन

(ix) पॉली ए पॉलिमरेज़: यह आरएनए के 3’ सिरे के हाइड्रॉक्सिल समूह में एडेनिन अवशेषों को शामिल करता है (चित्र 3.8)।

चित्र 3.8: पॉली ए पॉलिमरेज़ द्वारा dATP का संलयन

3.4 डीएनए स्थानांतरण की विधियाँ

किसी विदेशी डीएनए अणु को उसके आसपास के वातावरण से होस्ट कोशिका (प्रोकैरियोटिक या यूकैरियोटिक) में स्थानांतरित करना rDNA प्रौद्योगिकी के मूलभूत चरणों में से एक है। प्रकृति में, बैक्टीरिया अपने आसपास से विदेशी डीएनए अणुओं को तीन अलग-अलग तरीकों से प्राप्त करते हैं, जो हैं: (i) ट्रांसफॉर्मेशन, (ii) ट्रांसडक्शन और (iii) कॉन्जुगेशन।

(i) रूपांतरण: रूपांतरण एक कोशिका की आनुवंशिक परिवर्तन है जो अपने आस-पास से कोशिका झिल्ली के माध्यम से बाह्य DNA अणु की प्रत्यक्ष ग्रहण से होता है और यह ग्रहणकर्ता के आनुवंशिक पदार्थ में सम्मिलित हो जाता है। विदेशी DNA अणु वाली ग्रहणकर्ता कोशिकाओं को रूपांतरित कोशिकाएँ कहा जाता है (चित्र 3.9)। रूपांतरण कुछ जीवाणु प्रजातियों में स्वाभाविक रूप से होता है।

चित्र 3.9: जीवाणुओं में रूपांतरण

(ii) संचारण: विषाणु कोशिका के जीनोम में विदेशी DNA के ग्रहण को भी मध्यस्थता कर सकते हैं। विषाणु जो विशिष्ट रूप से जीवाणु कोशिकाओं को संक्रमित करते हैं उन्हें जीवाणुभोजी कहा जाता है। जीवाणुभोजी संक्रमण के दौरान मेजबान में विघटन चक्र या लाइसोजेनिक जीवन चक्र का अनुसरण करते हैं। लाइसोजेनिक जीवन चक्र में, जीवाणुभोजी जीनोम जीवाणु DNA में सम्मिलित हो जाता है और कई पीढ़ियों तक निष्क्रिय रहता है। कुछ समय बाद जब फेज जीनोम मेजबान DNA से बाहर निकलता है, तो वह कभी-कभी जीवाणु DNA की छोटी अनुक्रमणिकाओं को अपने साथ ले जाता है। जीवाणु DNA युक्त फेज जीनोम को फिर फेज कोट प्रोटीनों में पैक किया जाता है ताकि एक पूर्ण, पुनः संयुक्त विषाणु कण बन सके। जब यह फेज एक जीवाणु कोशिका को संक्रमित करता है, तो जीवाणु DNA युक्त पुनः संयुक्त फेज जीनोम जीवाणु में प्रवेश करता है (चित्र 3.10)। ग्रहणकर्ता जीवाणु कोशिका को संचारित कहा जाता है।

चित्र 3.10: जीवाणुओं में ट्रांसडक्शन

(iii) संयुग्मन: संयुग्मन को एक जीवाणु से दूसरे जीवाणु में DNA के स्थानांतरण को कहा जाता है जो कोशिका-से-कोशिका प्रत्यक्ष संपर्क के माध्यम से होता है। जीवाणु कोशिका जो अपना DNA स्थानांतरित करती है उसे दाता कोशिका कहा जाता है और जो प्राप्त करती है उसे ग्राही कोशिका कहा जाता है। संयुग्मन सामान्यतः F प्लाज्मिड्स द्वारा मध्यस्थ होता है जो प्रजनन कारक या F-कारक कहलाने वाली DNA अनुक्रम को वहन करते हैं। F-कारक एक पतली नली जैसी संरचना पिलस उत्पन्न करता है, जिसके माध्यम से दाता कोशिका ग्राही से संपर्क बनाती है। दाता कोशिका में डबल-स्ट्रैंड F-प्लाज्मिड की एक स्ट्रैंड में एक एंजाइम रिलैक्सेज द्वारा निक बनाया जाता है और यह स्ट्रैंड पिलस के माध्यम से ग्राही कोशिका में स्थानांतरित की जाती है। दाता और ग्राही दोनों कोशिकाओं के अंदर सिंगल-स्ट्रैंड DNA प्रतिकृत होकर मूल F प्लाज्मिड के समान डबल-स्ट्रैंड F प्लाज्मिड बनाती है (चित्र 3.11)।

चित्र 3.11: जीवाणु संयुग्मन

rDNA प्रौद्योगिकी में, rDNA को अनेक विधियों द्वारा होस्ट कोशिकाओं में प्रस्तुत (स्थानांतरित) किया जाता है। विदेशी DNA अणुओं को होस्ट कोशिकाओं में पेश करने के लिए रासायनिक (कैल्शियम क्लोराइड, लिपोफेक्शन आदि) और भौतिक (इलेक्ट्रोपोरेशन, सूक्ष्मइंजेक्शन और जीन गन) विधियाँ सामान्यतः प्रयुक्त होती हैं। कैल्शियम क्लोराइड विधि में, स्थानांतरित किए जाने वाले DNA को धनात्मक आवेशित कैल्शियम और DNA के ऋणात्मक आवेशित समूह युक्त विलयन में मिलाया जाता है ताकि एक संकुल बन सके। होस्ट कोशिकाएँ ताप झटके की प्रक्रिया द्वारा विदेशी DNA अणु को ग्रहण कर लेती हैं। इलेक्ट्रोपोरेशन विधि में, होस्ट कोशिकाओं की झिल्ली पर अस्थायी सूक्ष्म छिद्र तब बनते हैं जब उन्हें विदेशी DNA अणुओं की उपस्थिति में हल्के विद्युत धारा के संपर्क में लाया जाता है। पुनःसंयोजी DNA अणु इन अस्थायी सूक्ष्म छिद्रों के माध्यम से होस्ट कोशिकाओं के अंदर प्रवेश कर जाते हैं। लिपोफेक्शन (या लिपोसोम ट्रांस्फेक्शन) एक तकनीक है जिसमें जीनेटिक पदार्थ को कोशिका में इंजेक्ट किया जाता है लिपोसोम्स के माध्यम से, जो वेसिकल्स होते हैं जो कोशिका झिल्ली के साथ आसानी से विलय कर सकते हैं क्योंकि दोनों ही फॉस्फोलिपिड द्विस्तर से बने होते हैं। विदेशी DNA अणुओं को विशेष स्वचालित सूक्ष्मइंजेक्शन उपकरण की सहायता से सीधे होस्ट कोशिकाओं के केंद्रक में प्रस्तुत किया जा सकता है। बायोलिस्टिक विधि में, एक जीन गन (कण गन) की सहायता से, सूक्ष्म कण (सोना, निकल, टंगस्टन) जो विदेशी DNA से लेपित होते हैं, उच्च वेग से कोशिकाओं पर बमबारी किए जाते हैं ताकि विदेशी DNA अणु कोशिका के अंदर प्रवेश कर सके (चित्र 3.12)।

आकृति 3.12: DNA स्थानांतरण की विधियाँ (a) रासायनिक $\left(\mathrm{CaCl}_{2}\right)$, (b) इलेक्ट्रोपोरेशन, (c) होस्ट कोशिका में DNA स्थानांतरण की लिपोफेक्शन विधि, (d) सूक्ष्मइंजेक्शन और (e) बायोलिस्टिक विधि

3.5 स्क्रीनिंग और चयन

पुनःसंयोजक वेक्टरों के साथ रूपांतरित बैक्टीरिया का चयन एक सफल क्लोनिंग प्रयोग के लिए सबसे आवश्यक चरण है। यहाँ उद्देश्य है, रूपांतरित कोशिकाओं की पहचान करना जिनमें पुनःसंयोजक वेक्टर हो, अरूपांतरित कोशिकाओं के मिश्रण से। प्लाज्मिड में सम्मिलन के सम्मिलन की सफलता दर और पुनःसंयोजक प्लाज्मिडों को बैक्टीरिया में स्थानांतरण की दर बहुत कम होती है। इसलिए, सम्मिलन के बिना बड़ी संख्या में बैक्टीरियल आबादी से सम्मिलन युक्त प्लाज्मिड वाले कुछ बैक्टीरिया का चयन करना कठिन होता है।

पुनर्संयोजित कोशिकाओं के चयन की विधि उस सिद्धांत पर आधारित है जिसमें पुनर्संयोजित DNA वाले मेज़बानों में मौजूद जैविक लक्षणों में अंतर होता है उन मेज़बानों से जिनमें पुनर्सयोजित DNA नहीं है। इस प्रकार, पुनर्संयोजित कोशिकाओं को अ-पुनर्संयोजितों से उनके कुछ लक्षणों के अभिव्यक्त या अ-अभिव्यक्त होने के आधार पर अलग किया जाता है, जैसे कि प्रतिजैविक प्रतिरोध, या कुछ विशिष्ट प्रोटीनों जैसे $\beta$-गैलेक्टोसिडेज़ या ग्रीन फ्लोरेसेंट प्रोटीन (GFP) की अभिव्यक्ति, या किसी पोषक तत्व की आवश्यकता पर निर्भरता/अनिर्भरता, जैसे कि अमीनो अम्ल ल्यूसीन। इस सिद्धांत के आधार पर, चयन प्रक्रिया को दो मुख्य प्रकारों में बाँटा जा सकता है जैसा कि निम्नलिखित खंड में वर्णित है।

(i) पुनर्संयोजितों का प्रत्यक्ष चयन: चयन की इस विधि में, रूपांतरित कोशिकाओं को अ-रूपांतरित कोशिकाओं से कुछ लक्षणों की अभिव्यक्ति के आधार पर अलग किया जाता है। उदाहरण के लिए, जीवाणु कोशिकाएँ (मेज़बान) किसी विशेष प्रतिजैविक के प्रति प्रतिरोधी नहीं होतीं, लेकिन जब वे प्रतिजैविक प्रतिरोधी जीन युक्त प्लाज़्मिड ग्रहण कर लेती हैं, तो वे उस विशिष्ट प्रतिजैविक के प्रति प्रतिरोधी हो जाती हैं। ये कोशिकाएँ प्रतिजैविक युक्त माध्यम में जीवित रहेंगी और वृद्धि करेंगी, जबकि प्लाज़्मिड रहित मेज़बान कोशिकाएँ प्रतिजैविक के संपर्क में आने पर मारी जाएँगी।

(ii) पुनर्संयोजकों का चयन समावेशी निष्क्रियता द्वारा: यह प्रत्यक्ष चयन विधि की तुलना में अधिक कुशल है। इस विधि में, एक ऐसा सदिश प्रयोग किया जाता है जिसमें दो चिह्न होते हैं (या तो दो प्रतिजैविक प्रतिरोधी जीन, या एक प्रतिजैविक प्रतिरोधी जीन और एक lacZ जीन)। जब रुचि का जीन (समावेश DNA) सदिश के चयन चिह्न जीनों में से एक में समाविष्ट किया जाता है, तो इसकी अभिव्यक्ति बाधित हो जाती है और इसे समावेशी निष्क्रियता कहा जाता है। आइए एक ऐसे प्लाज्मिड का प्रयोग करें जिसमें दो प्रतिजैविक प्रतिरोध जीन हैं—एक ऐम्पिसिलिन के लिए $\left(a m p^{R}\right.$ जीन) और दूसरा टेट्रासाइक्लिन के लिए (tet ${ }^{R}$ जीन)। लक्ष्य DNA (समावेश) को प्लाज्मिड के $a m p^{R}$ जीन में समाविष्ट किया जाता है जिससे वे पुनर्संयोजी प्लाज्मिड बन जाते हैं। अब हमारे पास समावेश के साथ और बिना समावेश के प्लाज्मिड हैं। जब इस प्लाज्मिड मिश्रण को पहले वर्णित विधि के अनुसार जीवाणु संवर्ध में मिलाया जाता है, तो तीन प्रकार की मेज़बान जीवाणु कोशिकाओं की आबादियाँ होंगी: (i) प्लाज्मिड रहित मेज़बान कोशिकाएँ (अ-रूपांतरित), (ii) समावेश रहित प्लाज्मिड वाली रूपांतरित मेज़बान कोशिकाएँ, और (iii) पुनर्संयोजी प्लाज्मिड वाली रूपांतरित मेज़बान कोशिकाएँ (समावेश सहित)। अब यह आवश्यक है कि उन कोशिकाओं की पहचान की जाए जिन्होंने पुनर्संयोजी प्लाज्मिड प्राप्त किया है। यह स्क्रीनिंग प्रक्रिया ऐम्पिसिलिन प्रतिरोध के गुणधर्म पर आधारित है जो पुनर्संयोजी प्लाज्मिड रखने वाली कोशिका में लुप्त हो जाता है। समावेश $a m p^{R}$ जीन में क्लोन हो जाता है जिससे ऐम्पिसिलिन प्रतिरोध जीन (amp ${ }^{R}$) की समावेशी निष्क्रियता हो जाती है (चित्र 3.13)। जब इन जीवाणुओं को टेट्रासाइक्लिन युक्त माध्यम पर लगाया जाता है, तो अ-रूपांतरित कोशिकाएँ समाप्त हो जाती हैं क्योंकि वे इसके प्रति संवेदनशील होती हैं। केवल रूपांतरित कोशिकाएँ (कार्यशील tet ${ }^{R}$ सहित) ही गुणन करके कॉलोनियाँ बनाती हैं क्योंकि वे इसके प्रति प्रतिरोधी होती हैं। दो प्रकार की कॉलोनियाँ होंगी (मास्टर प्लेट)—एक समावेश रहित प्लाज्मिड वाली रूपांतरित कोशिकाओं की (अ-पुनर्संयोजी) और दूसरी समावेश युक्त प्लाज्मिड वाली रूपांतरित कोशिकाओं की (पुनर्संयोजी) (चित्र 3.13)। नाइट्रोसेल्युलोस झिल्ली का प्रयोग करके, मास्टर प्लेट की कॉलोनियों से जीवाणु कोशिकाओं को ऐम्पिसिलिन युक्त ठोस माध्यम पर लगाया जाता है। समावेश रहित सदिश वाली रूपांतरित कोशिकाएँ ही गुणन करके कॉलोनियाँ बनाती हैं (प्रतिरूप प्लेट) जबकि पुनर्संयोजी सदिश वाली रूपांतरित कोशिकाएँ नहीं बढ़ती क्योंकि उनका $a m p^{R}$ जीन निष्क्रिय हो चुका है। अब, यदि हम मास्टर प्लेट की तुलना प्रतिरूप प्लेट से करें, तो वे कॉलोनियाँ जो मास्टर प्लेट में मौजूद हैं और प्रतिरूप प्लेट में अनुपस्थित हैं, वे रूपांतरित कोशिकाएँ हैं जिनमें रुचि के DNA समावेश युक्त पुनर्संयोजी सदिश है (चित्र 3.13)।

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चित्र 3.13: सम्मिलन-निष्क्रियण द्वारा पुनःसंयोजकों का चयन

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चित्र 3.14: नीला-सफेद चयन विधि

नीला-सफेद चयन विधि पुनःसंयोजी रूपांतरित कोशिकाओं के चयन के लिए सम्मिलन-निष्क्रियण चयन विधि का एक अन्य उदाहरण है। इस विधि में, प्लाज्मिड सदिश में उपस्थित lacZ जीन (अध्याय 2 के सदिश खंड देखें) β-गैलेक्टोसिडेज एंजाइम को अभिव्यक्त करता है। β-गैलेक्टोसिडेज एक रंगहीन क्रोमोजेनिक सब्सट्रेट X-gal (5 ब्रोमो-4-क्लोरो-3 इंडोलिल-बीटा D-गैलेक्टोसाइड), लैक्टोज का एक एनालॉग, को विभाजित कर 5-ब्रोमो-4-क्लोरो-इंडोक्सिल बनाता है, जो स्वतः डाइमराइज़ होकर एक अघुलनशील नीला वर्णक 5,5’-डाइब्रोमो-4,4’-डाइक्लोरो-इंडिगो उत्पन्न करता है। जब प्लाज्मिड में lacZ जीन सम्मिलित डीएनए के सम्मिलन के कारण निष्क्रिय हो जाता है, तो पुनःसंयोजी प्लाज्मिड वाले मेज़बानों में β-गैलेक्टोसिडेज एंजाइम अभिव्यक्त नहीं होता है (चित्र 3.14)।

रूपांतरण प्रयोग के दौरान, जीवाणु कोशिकाओं (रूपांतरित और अरूपांतरित दोनों) को एम्पीसिलिन और X-gal-IPTG (आइसोप्रोपिल $\beta$-D-1-थायोगैलेक्टोपाइरैनोसाइड) युक्त ठोस माध्यम पर प्लेट किया जाता है। अरूपांतरित कोशिकाएं समाप्त हो जाती हैं और केवल रूपांतरित कोशिकाएं ही गुणन करके कॉलोनियाँ बनाती हैं। दो प्रकार की कॉलोनियाँ बनेंगी, अर्थात् नीले रंग और सफेद रंग की कॉलोनियाँ। नीली कॉलोनियों में जीवाणु कोशिकाओं में लैकZ के साथ एक अबाधित वेक्टर होता है (कोई सम्मिलन नहीं), जबकि सफेद कॉलोनियों में, जहाँ X-gal हाइड्रोलाइज़ नहीं होता है, लैकZ में एक सम्मिलन की उपस्थिति दर्शाता है, जो सक्रिय $\beta$-गैलेक्टोसिडेस के निर्माण को बाधित करता है।

रूपांतरित जीवाणुओं की स्क्रीनिंग के लिए वैकल्पिक विधियाँ विकसित की गई हैं, जैसे GFP। अवधारणा लैकZ के समान है जिसमें एक DNA सम्मिलन वेक्टर के भीतर कोडिंग अनुक्रम को बाधित कर सकता है और इस प्रकार GFP उत्पादन को बाधित कर सकता है जिससे गैर-फ्लोरोसिंग जीवाणु बनते हैं। जीवाणु जिनमें पुनर्संयोजी वेक्टर (वेक्टर + सम्मिलन) होता है, वे सफेद होंगे और GFP प्रोटीन अभिव्यक्त नहीं करेंगे, जबकि गैर-पुनर्संयोजी (वेक्टर) UV प्रकाश के तहत फ्लोरोस करेंगे।

3.6 ब्लॉटिंग तकनीकें

ब्लॉटिंग तकनीकों का वैज्ञानिकों द्वारा डीएनए, आरएनए और प्रोटीनों के मिश्रण से इनकी पहचान और पृथक्करण के लिए व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। यह तकनीक रुचि के अणु को एक सपोर्ट पर स्थिर करती है, जो नाइट्रोसेल्युलोज़ या नायलॉन या पॉलीविनिलिडीन डाइफ्लोराइड (PVDF) झिल्ली होती है। यह विशिष्ट न्यूक्लिक अम्लों और जीनों की पहचान के लिए हाइब्रिडाइज़ेशन तकनीकों का उपयोग करती है। नाइट्रोसेल्युलोज़ और PVDF दोनों झिल्लियाँ अत्यधिक जलरोधक और रसायनों की विस्तृत श्रृंखला के प्रति रासायनिक रूप से प्रतिरोधी होती हैं। इनमें प्रोटीनों और न्यूक्लिक अम्लों से बंधने के लिए उच्च सहावयवता होती है। एक बार प्रोटीन या न्यूक्लिक अम्ल झिल्ली पर स्थानांतरित हो जाने के बाद, वे झिल्ली पर स्थिर हो जाते हैं। किसी विशिष्ट प्रोटीन को झिल्ली पर इसके विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करके पहचाना जा सकता है। इसी प्रकार, किसी विशिष्ट न्यूक्लिक अम्ल प्रोब का उपयोग करके, हाइब्रिडाइज़ेशन द्वारा झिल्ली पर वांछित न्यूक्लिक अम्ल को पहचाना जा सकता है। ब्लॉटिंग तकनीकों में उपयोग किए जाने वाले पहचान तरीके क्रोमोजेनिक, फ्लोरेसेंस, केमिल्यूमिनेसेंस या रेडियोधर्मी होते हैं। जैवप्रौद्योगिकी में मुख्य रूप से तीन प्रकार की ब्लॉटिंग तकनीकों का उपयोग किया जाता है—सदर्न ब्लॉटिंग, नॉर्दर्न ब्लॉटिंग और वेस्टर्न ब्लॉटिंग।

सदर्न ब्लॉट तकनीक: मूल ब्लॉटिंग तकनीक ब्रिटिश जीवविज्ञानी एडविन सदर्न द्वारा आविष्कार की गई थी जिसे डीएनए नमूनों में विशिष्ट अनुक्रम का पता लगाने की विधि के रूप में प्रयोग किया जाता है। सदर्न ब्लॉटिंग में, बड़े डीएनए अणुओं को प्रतिबंधक एंडोन्यूक्लिएज द्वारा छोटे टुकड़ों में काटा जाता है। डीएनए खंडों को उनके आकार के आधार पर आगार जेल पर विद्युत्क्रियासिस द्वारा पृथक किया जाता है। जेल से डीएनए को नाइट्रोसेल्युलोस झिल्ली पर केशिका क्रिया के माध्यम से स्थानांतरित किया जाता है। इसके लिए, एक ठोस आधार को एक ट्रे में रखा जाता है। बफर विलयन को ट्रे में ठोस आधार की आधी ऊंचाई तक डाला जाता है। एक व्हाटमान कागज की पट्टी को ठोस आधार पर रखा जाता है जो दोनों ओर से बफर को छूती है। डीएनए युक्त जेल को इस व्हाटमान पट्टी पर रखा जाता है। जेल के ऊपर नायलॉन या नाइट्रोसेल्युलोस झिल्ली की एक शीट रखी जाती है। जेल पर समान रूप से दबाव डालने के लिए झिल्ली और जेल के ऊपर फिल्टर कागजों या पेपर टॉवेलों का ढेर और वजन रखा जाता है। बफर विलयन केशिका क्रिया द्वारा जेल और झिल्ली से होकर फिल्टर कागजों तक जाता है। बफर विलयन के साथ-साथ डीएनए सकारात्मक आवेश युक्त झिल्ली तक जाता है। न्यूक्लिक अम्लों के स्थानांतरण के बाद झिल्लियां अपने संबंधित जेल की प्रतिकृति के रूप में कार्य करती हैं। झिल्ली को फिर बेक किया जाता है ताकि स्थानांतरित डीएनए को स्थायी रूप से झिल्ली से जोड़ा जा सके जिसे प्रोब के साथ मिलाया जाता है। ब्लॉट झिल्ली को फिर धोया जाता है ताकि अनहाइब्रिडाइज्ड प्रोब को हटाया जा सके। झिल्ली पर वांछित डीएनए अनुक्रम को बाद में प्रोब का उपयोग करके पता लगाया जाता है (चित्र 3.15)। प्रोब एकल डीएनए स्ट्रैंड होता है, जो उस अनुक्रम के पूरक होता है जिसे पहचानना है। प्रोब को एक पता लगाने वाले टैग के साथ लेबल किया जाता है जो रेडियोधर्मिता, प्रतिदीप्ति या रासायनिक प्रकृति का हो सकता है। लेबल किया गया डीएनए प्रोब झिल्ली में अपने पूरक स्ट्रैंड के साथ ऐनील करता है। लक्ष्य डीएनए खंड का स्थान एक्स-रे फिल्म पर ऑटोरेडियोग्राफी द्वारा दृश्यीकरण करके पहचाना जाता है।

चित्र 3.15: सदर्न ब्लॉटिंग द्वारा वांछित डीएनए की पहचान

नॉर्दर्न ब्लॉटिंग तकनीक: यह आरएनए के मिश्रण में विशिष्ट आरएनए अणुओं का पता लगाने के लिए प्रयोग की जाती है। इसे अमेरिकी वैज्ञानिकों जे. अल्वाइन, डेविड केंप और जॉर्ज स्टार्क ने 1977 में विकसित किया था। सदर्न ब्लॉटिंग की तरह, यह भी एक समसूत्रित ऊतक नमूने या कोशिकाओं से कुल आरएनए के निष्कर्षण से शुरू होता है। इन्हें उनके आकार के आधार पर इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा एगरोज जेल पर अलग किया जाता है। फिर इन्हें एक झिल्ली पर स्थानांतरित किया जाता है जहाँ वे स्थिर हो जाते हैं। नॉर्दर्न ब्लॉटिंग में उपयोग के लिए धनात्मक आवेश वाली नायलॉन झिल्ली सबसे प्रभावी होती है क्योंकि ऋणात्मक आवेश वाले न्यूक्लिक अम्लों की इनके प्रति उच्च आकर्षण होता है। ब्लॉटिंग के लिए प्रयोग होने वाला स्थानांतर बफ़र सामान्यतः फॉर्मामाइड युक्त होता है क्योंकि यह प्रोब-आरएनए अन्योन्यक्रिया के ऐनिलिंग तापमान को घटाता है, इस प्रकार उच्च तापमान की आवश्यकता समाप्त हो जाती है, जिससे आरएनए के क्षय होने का खतरा रहता है। एक बार आरएनए को झिल्ली पर स्थानांतरित कर दिया जाता है, तो इसे पराबैंगनी प्रकाश या ऊष्मा द्वारा झिल्ली से सहसंयोजक बंधन के माध्यम से स्थिर कर दिया जाता है। फिर इसे रेडियोधर्मी प्रोबों के साथ मिलाया जाता है।

प्रोब विशेष रूप से रुचि के RNA के लिए डिज़ाइन किए जाते हैं, ताकि वे ब्लॉट पर रुचि के अनुक्रम के अनुरूप RNA अनुक्रमों के साथ संकरित हों। ब्लॉट को अब अतिरिक्त प्रोब हटाने के लिए धोया जाता है। फिर लेबल किए गए प्रोब को ऑटोरेडियोग्राफी द्वारा पता लगाया जाता है जो X-रे फिल्म पर गहरे बैंड के रूप में दिखाई देता है या फ्लोरोसेंट लेबल द्वारा (चित्र 3.16)।

चित्र 3.16: नॉर्दर्न ब्लॉटिंग द्वारा वांछित RNA की पहचान

वेस्टर्न ब्लॉटिंग तकनीक: इस नाम की शुरुआत W. Neal Burnette ने 1981 में की थी। यह एक ऐसी तकनीक है जिसका उपयोग ऊतक होमोजेनेट या निकाले गए नमूने में विशिष्ट प्रोटीनों का पता लगाने के लिए किया जाता है। प्रोटीनों को एक स्रोत से अलग किया जाता है। उन्हें उनकी इलेक्ट्रोफोरेटिक गतिशीलता के आधार पर SDS-PAGE जेल पर अलग किया जाता है जो प्रोटीनों के आवेश, अणु आकार और संरचना पर निर्भर करती है। उन्हें नाइट्रोसेल्युलोस झिल्ली पर स्थानांतरित किया जाता है। वांछित प्रोटीन को झिल्ली पर प्रोटीन के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करके पता लगाया जाता है (चित्र 3.17)।

चित्र 3.17: वेस्टर्न ब्लॉटिंग द्वारा वांछित प्रोटीन की पहचान

तीनों ब्लॉटिंग तकनीकों का उपयोग करके, कोई व्यक्ति एक जीन और उसके अभिव्यक्ति की पहचान कर सकता है। उदाहरण के लिए, डीएनए अनुक्रम में एक जीन की पहचान सदर्न ब्लॉटिंग द्वारा की जा सकती है, और इसके ट्रांसक्रिप्ट्स (आरएनए) की पहचान नॉर्दर्न ब्लॉटिंग द्वारा की जा सकती है, और अंत में मेसेंजर आरएनए से प्रोटीन की अभिव्यक्ति (अनुवाद द्वारा) वेस्टर्न ब्लॉटिंग द्वारा।

बॉक्स 3: ईस्टर्न ब्लॉट

ईस्टर्न ब्लॉट का उपयोग प्रोटीनों की विशिष्ट पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन की पहचान के लिए किया जाता है। प्रोटीनों को जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा अलग किया जाता है और फिर उन्हें एक ब्लॉटिंग मैट्रिक्स पर स्थानांतरित किया जाता है जहां विशिष्ट सब्सट्रेट्स (कॉलेरा टॉक्सिन, कॉनकेनावेलिन, फॉस्फोमोलिब्डेट, आदि) या एंटीबॉडी द्वारा पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों का पता लगाया जाता है।

3.7 पॉलिमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर)

कई आणविक और आनुवंशिक प्रयोगों के लिए डीएनए की महत्वपूर्ण मात्रा की आवश्यकता होती है। कुछ प्रतियों से डीएनए की कई प्रतियां उत्पन्न करने के लिए, केरी बी. मुलिस द्वारा एक तकनीक विकसित की गई थी, जिसे ‘पॉलिमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर)’ कहा जाता है। इस तकनीक में, डीएनए की बहुत कम मात्रा को चरघातांकीय रूप से प्रवर्धित किया जा सकता है ताकि हजारों से लाखों प्रतियां उत्पन्न हो सकें। पीसीआर, जिसे कभी-कभी ‘आणविक फोटोकॉपी’ कहा जाता है, को अक्सर आणविक जीव विज्ञान में सबसे महत्वपूर्ण वैज्ञानिक प्रगति के रूप में प्रशंसित किया जाता है, जिसने डीएनए के अध्ययन को इतना क्रांतिकारी बना दिया कि इसके आविष्कारक, केरी बी. मुलिस को 1993 में रसायन विज्ञान के लिए नोबेल पुरस्कार प्रदान किया गया।

पीसीआर तकनीक उस सिद्धांत पर आधारित है जिसे कोशिकाएँ अपनी डीएनए की प्रतिकृति बनाने के लिए उपयोग करती हैं। जैसा कि नाम से स्पष्ट है, यह एक श्रृंखला अभिक्रिया है जिसे बार-बार चक्रों में किया जाता है और इसमें गरम करना और ठंडा करना शामिल होता है जिसे थर्मल साइक्लिंग कहा जाता है जो एक मशीन थर्मोसाइक्लर द्वारा की जाती है। इसके लिए एक ऐसा ऊष्मा-स्थिर डीएनए पॉलिमरेज़ एंजाइम चाहिए जो टेम्पलेट स्ट्रैंड्स पर नए डीएनए स्ट्रैंड बना सके लगभग 72 से $78^{\circ} \mathrm{C}$ के उच्च तापमान पर (एक तापमान जिस पर मानव या ई. कोलाई डीएनए पॉलिमरेज़ कार्यरत नहीं रहता)। पीसीआर में सामान्यतः प्रयुक्त डीएनए पॉलिमरेज़ को टैक पॉलिमरेज़ कहा जाता है, यह एक ऐसा एंजाइम है जिसे थर्मोफिलिक जीवाणु Thermus aquaticus से पृथक किया गया है जो गर्म झरनों में पाया जाता है। एक अन्य एंजाइम पीएफयू पॉलिमरेज़ जिसे Pyrococcus furiosus से पृथक किया गया है, व्यापक रूप से उपयोग में लाया जाता है क्योंकि यह डीएनए की प्रतिलिपि बनाते समय अधिक सटीकता दिखाता है। अन्य डीएनए पॉलिमरेज़ों की तरह, टैक पॉलिमरेज़ को भी एक प्राइमर की आवश्यकता होती है, जो न्यूक्लिओटाइड्स का एक छोटा क्रम होता है जो डीएनए संश्लेषण प्रारंभ करने के लिए 3’-OH सिरा प्रदान करता है। प्रत्येक पीसीआर अभिक्रिया में दो प्रकार के एकल स्ट्रैंड वाले संश्लेषित डीऑक्सीऑलिगोन्यूक्लिओटाइड प्राइमर (जिन्हें अग्र और पश्च प्राइमर कहा जाता है) उपयोग किए जाते हैं जो टेम्पलेट स्ट्रैंड्स में लक्षित क्षेत्र (वह क्षेत्र जिसकी प्रतिकृति बनानी है) के दोनों ओर स्थित डीएनए अनुक्रमों के पूरक होते हैं। इन्हें उस डीएनए टेम्पलेट के अनुक्रम की पूर्व-ज्ञात जानकारी से डिज़ाइन किया जाता है जिसे प्रवर्धित करना होता है।

चित्र 3.18: पॉलिमरेज़ श्रृंखला अभिक्रिया के चरण

पीसीआर में तीन चरण होते हैं - विकृतीकरण, ऐनीलिंग और विस्तार (चित्र 3.18)। पहला चरण अर्थात् विकृतीकरण डबल स्ट्रैंडेड डीएनए को लगभग $94-95^{\circ} \mathrm{C}$ तक गर्म करके पूरा किया जाता है, जिसे प्रवर्धित किया जाना है। उच्च तापमान पर, डीएनए अणु की दो पूरक स्ट्रैंड्स को बांधने वाले हाइड्रोजन बंध टूट जाते हैं और प्रत्येक स्ट्रैंड अपनी नई पूरक स्ट्रैंड के संश्लेषण के लिए टेम्पलेट के रूप में कार्य करती है। दूसरा चरण ऐनीलिंग है जिसमें तापमान लगभग $50-55^{\circ} \mathrm{C}$ तक घटाया जाता है ताकि विशिष्ट प्राइमर अपने-अपने टेम्पलेट स्ट्रैंड्स से पूरक स्थलों पर बंध सकें और प्रतिलिपि बनाने के प्रारंभिक बिंदु के रूप में कार्य कर सकें। तापमान घटाना प्राइमर की लंबाई और प्राइमर के अनुक्रम पर निर्भर करता है। तीसरे चरण अर्थात् विस्तार में, तापमान लगभग $72^{\circ} \mathrm{C}$ तक बढ़ाया जाता है, और ताप-स्थिर डीएनए पॉलिमरेज ऐनील हुए प्राइमरों के 3’ $-\mathrm{OH}$ सिरों पर डिऑक्सीराइबोन्यूक्लियोटाइड्स (dNTPs - dATP, dTTP, dCTP और dGTP) जोड़ना शुरू करता है। इस प्रकार, प्रत्येक टेम्पलेट पर $5^{\prime}$ से $3^{\prime}$ दिशा में डीएनए की एक नई श्रृंखला बढ़ती है। पीसीआर द्वारा बनाई गई डीएनए स्ट्रैंड्स की प्रतियां एम्प्लिकॉन के रूप में जानी जाती हैं। चक्र के अंत में, फिर से तापमान बढ़ाया जाता है और प्रक्रिया दोहराई जाती है। प्रत्येक चक्र के बाद डीएनए प्रतियों की संख्या दोगुनी हो जाती है और प्रत्येक चक्र के अंत में प्रतियों की संख्या $2^{n}$ होगी (जहां ’n’ चक्र संख्या है)। आमतौर पर, एक विशिष्ट पीसीआर प्रतिक्रिया में 25 से 30 चक्र किए जाते हैं।

पीसीआर में, प्रतिक्रिया के अंत में उत्पाद को जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा विश्लेषित किया जाता है (अंत-बिंदु विश्लेषण)। फिर जेल प्लेट की बैंड में डीएनए की मात्रा का अनुमान कंप्यूटर प्रोग्राम द्वारा बैंड की तीव्रता मापकर लगाया जाता है और इसे मात्रात्मक डेटा में बदला जाता है। इसे अर्ध-मात्रात्मक पीसीआर कहा जाता है। यदि डीएनए सामग्री मरएनए से रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज द्वारा बनाई जाती है और प्रवर्धन के लिए पीसीआर में प्रयोग की जाती है (चित्र 3.19), तो इस विधि को रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पीसीआर (आरटी-पीसीआर) कहा जाता है।

चित्र 3.19: आरटी-पीसीआर के चरण।

पीसीआर तकनीक में नवीनतम प्रगति रीयल-टाइम मात्रात्मक पीसीआर (रीयल-टाइम $\mathrm{qPCR}$) है। इस विधि में, फ्लोरोसेंट मार्करों का उपयोग किया जाता है जिनकी डबल स्ट्रैंडेड डीएनए से विशिष्ट बंधन आकर्षण होता है। जब ये डीएनए से बंधते हैं, तो फ्लोरोसेंस व्यवहार प्रदर्शित करते हैं। फ्लोरोसेंस उत्सर्जन को एक डिटेक्टर द्वारा पहचाना और मात्रात्मक रूप से मापा जाता है। उत्सर्जित फ्लोरोसेंस की मात्रा सीधे डबल स्ट्रैंडेड पीसीआर उत्पाद की मात्रा के समानुपाती होती है। चूंकि प्रत्येक पीसीआर चक्र के बाद बने पीसीआर उत्पाद की मात्रा को मापा जा सकता है, इसलिए इसे रीयल-टाइम मात्रात्मक पीसीआर कहा जाता है। रीयल-टाइम पीसीआर में प्रयोग होने वाले फ्लोरोसेंट डाइज़ में से एक SYBR ग्रीन है। यह डाइ केवल डबल स्ट्रैंडेड डीएनए से बंधता है।

PCR प्रतिक्रिया जिस मशीन में संचालित की जाती है, उसे थर्मोसाइक्लर कहा जाता है। ये स्वचालित मशीनें होती हैं जिनमें नियंत्रण बिंदु होते हैं जहाँ तीन तापमान ग्रेडिएंट (विकृतीकरण, ऐनीलिंग और विस्तार के लिए) विभिन्न समय अवधियों के लिए सेट किए जा सकते हैं। रियल-टाइम qPCR थर्मोसाइक्लर के लिए इसमें एक डिटेक्टर होता है जो उत्सर्जित फ्लोरेसेंस को मापता है। रियल-टाइम PCR में, पारंपरिक PCR की तरह जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस की आवश्यकता नहीं होती है।

PCR के कई अनुप्रयोग आण्विक जीव विज्ञान और rDNA प्रौद्योगिकी में हैं। PCR के अनुप्रयोगों में से एक mRNA की मात्रा निर्धारित करना है ताकि किसी जीन की अभिव्यक्ति का आकलन किया जा सके। इसका उपयोग अपराध स्थलों और जीवाश्मों से एकत्र किए गए सूक्ष्म DNA नमूनों को आगे की जांच के लिए प्रवर्धित करने के लिए भी किया जाता है।

बॉक्स 4

नोवेल कोरोनावायरस (nCoV) सीवियर एक्यूट रेस्पिरेटरी सिंड्रोम कोरोनावायरस-2 (SARS-CoV-2) और COVID-19 रोग (कोरोना महामारी)

वायरस टैक्सोनॉमी पर अंतरराष्ट्रीय समिति ने 12 फरवरी, 2020 को आधिकारिक रूप से 2019-nCoV वायरस का नाम SARS-CoV-2 रखा, और उसी दिन विश्व स्वास्थ्य संगठन (WHO) ने इसे महामारी कोरोनावायरस रोग 2019 (COVID-19) का कारण घोषित किया। SARS$\mathrm{CoV}-2$ एक लिपिड-आवेष्टित वायरस है जिसके बाहरी सतह पर ताज जैसे काँटे होते हैं।

SARS-CoV-2 का जीनोम एकल-स्ट्रैंड धनात्मक (सेंस) RNA है जिसकी लंबाई $30 \mathrm{~kb}$ है और G+C सामग्री 38% है। वायरल RNA के दो-तिहाई भाग में कई गैर-संरचनात्मक प्रोटीन (NSPs) कूटबद्ध होते हैं जिनमें पपेन-जैसा प्रोटिएस (PLpro), 3-काइमोट्रिप्सिन-जैसा प्रोटिएस (3CLpro), RNA-निर्भर RNA पॉलिमरेज (RdRp), हेलिकेस (Hel) और एक्सोन्यूक्लिएस (ExoN) प्रमुख प्रोटीन हैं जबकि शेष सहायक प्रोटीन हैं जो वायरस के ट्रांसक्रिप्शन और प्रतिकृतिकरण में संलग्न हैं। वायरस जीनोम का शेष भाग चार आवश्यक संरचनात्मक प्रोटीनों को कूटबद्ध करता है, जिनमें स्पाइक (S) ग्लाइकोप्रोटीन, लघु लिफाफा (E) प्रोटीन, झिल्ली (M) प्रोटीन और N फॉस्फोप्रोटीन (N) प्रोटीन शामिल हैं, और कई सहायक प्रोटीन भी हैं जो मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में हस्तक्षेप करते हैं।

संरचना के आधार पर, RT-PCR परीक्षणों को कुशलतापूर्वक अनुकूलित किया गया है, और mRNA वैक्सीनों को डिज़ाइन किया गया है और प्रशासित किए जा रहे हैं (अध्याय 4)।

SARS-CoV-2 जीनोम संगठन और एक विरियन का आरेख। जीनोम में $5^{\prime}$-अनट्रांसलेटेड क्षेत्र ($5^{\prime \prime}$-UTR), ओपन-रीडिंग फ्रेम (ORFs) $1 a$ और $1 \mathrm{~b}$ गैर-संरचनात्मक प्रोटीनों, 3-काइमोट्रिप्सिन-जैसा प्रोटिएस (3CLpro), पपेन-जैसा प्रोटिएस (PLpro), हेलिकेस (Hel), और RNA-निर्भर RNA पॉलिमरेज (RdRp) के अतिरिक्त सहायक प्रोटीनों को कूटबद्ध करते हैं, अन्य ORFs संरचनात्मक $S$ प्रोटीन (S), E प्रोटीन (E), M प्रोटीन (M), और $N$ फॉस्फोप्रोटीन (N) के लिए कोड करते हैं।

बॉक्स 5: RT-PCR और COVID-19 जांच परीक्षण का अनुप्रयोग

RT-PCR COVID-19 जांच परीक्षण में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। यह रियल-टाइम रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पॉलिमरेज़ चेन रिएक्शन (rRT-PCR) परीक्षण के सिद्धांत पर आधारित है जो SARS-CoV-2 से न्यूक्लिक अम्ल की गुणात्मक पहचान करता है, जो निचले और ऊपरी श्वसन मार्ग के नमूनों [बलगम, ब्रोंको-एल्वियोलर लैवेज (BAL)] से एकत्रित किया जाता है, जिन्हें स्वास्थ्य देखभाल कर्मचारियों द्वारा COVID-19 के संदिग्ध व्यक्तियों से लिया जाता है।

RT-PCR परीक्षण का सिद्धांत अध्याय में वर्णित के समान है। परीक्षण के लिए, प्राइमर और प्रोब का चयन SARS-CoV-2 जीनोम के ओपन रीडिंग फ्रेम जीन क्षेत्र (ORF1a/b) और वायरल न्यूक्लियोकेप्सिड क्षेत्र (N), या स्पाइक प्रोटीन (S) से किया जाता है। किट में $N$ जीन, ORF1a/b जीन और मानव RNase P के लिए विशिष्ट प्राइमर/प्रोब होते हैं। ऊपरी और निचले श्वसन मार्ग के नमूनों से RNA को पृथक और शुद्ध किया जाता है, जिसे पहले रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन द्वारा cDNA में परिवर्तित किया जाता है और फिर रियल-टाइम PCR थर्मल साइकलर में प्रवर्धित किया जाता है। प्रोब में $5^{\prime}$ पर एक रिपोर्टर डाई और $3^{\prime}$ पर एक क्वेंचिंग डाई होती है। रिपोर्टर डाई से उत्सर्जित फ्लोरोसेंट संकेत क्वेंचर द्वारा अवशोषित हो जाते हैं, इसलिए यह संकेत उत्सर्जित नहीं करता है। प्रवर्धन के दौरान, प्रोब को टेम्प्लेट्स से बांधने की अनुमति दी जाती है और Taq एंजाइम ($5^{\prime}-3^{\prime}$ एक्सोन्यूक्लिएस गतिविधि) द्वारा काट दी जाती हैं, जिससे रिपोर्टर डाई क्वेंचर से अलग हो जाती है और फ्लोरोसेंट संकेत उत्पन्न होते हैं। फिर PCR उपकरण अनिवार्य रूप से एक रियल-टाइम प्रवर्धन वक्र खींचता है जो संकेत में परिवर्तन पर आधारित होता है, और अंततः SARS-CoV-2 नवेल कोरोनावायरस की न्यूक्लिक अम्ल स्तर पर गुणात्मक पहचान को साकार करता है। चित्र में दिखाए गए प्रवर्धन प्लॉट रियल-टाइम PCR प्रयोग की अवधि के दौरान उत्पाद के संचय को दर्शाते हैं। व्यक्तिगत नमूने से आने वाला फ्लोरोसेंट संकेत चक्र संख्या के विरुद्ध प्लॉट किया जाता है।

थ्रेशोल्ड चक्र या Ct मान वह चक्र संख्या है जिस पर प्रतिक्रिया के भीतर उत्पन्न फ्लोरोसेंस फ्लोरोसेंस थ्रेशोल्ड को पार करता है - एक फ्लोरोसेंट संकेत जो पृष्ठभूमि फ्लोरोसेंस से महत्वपूर्ण रूप से ऊपर होता है। Ct उन चक्रों की संख्या को संदर्भित करता है जो वायरल RNA को पहचानने योग्य स्तर तक प्रवर्धित करने के लिए आवश्यक होते हैं। थ्रेशोल्ड चक्र पर, प्रतिक्रिया के प्रारंभिक घातीय चरण के दौरान प्रवर्धन उत्पाद की पहचान योग्य मात्रा उत्पन्न हो चुकी होती है। Ct मान नमूने में रुचि के जीन की मात्रा के व्युत्क्रमानुपाती होता है।

3.8 डीएनए लाइब्रेरीज़

किसी जीव की जीनोम में मौजूद डीएनए अणु बेस-युग्मों की संख्या के मामले में बहुत बड़े होते हैं। आपके शरीर के किसी भी अंग से लिए गए डिप्लॉइड कोशिका में मौजूद डीएनए अणु का आकार लगभग $3 \times 10^{9} \mathrm{bp}$ होता है। एक जीनोम में जीन अनुक्रम यादृच्छिक रूप से व्यवस्थित होते हैं और रुचि के किसी जीन का चयन या पृथक्करण एक बड़ा कार्य है, विशेषकर तब जब जीनोम अनुक्रम ज्ञात न हों। इसके अतिरिक्त, जीनोम का एक छोटा भाग ही mRNA बनाने के लिए ट्रांसक्राइब होता है, जबकि जीनोम का एक बड़ा भाग अनट्रांसक्राइब रहता है। किसी रुचि के जीन या जीनोम के उस अनुक्रम का पृथक्करण बहुत कठिन होगा जिसका स्थान और अनुक्रम ज्ञात नहीं है। इसलिए, डीएनए लाइब्रेरीज़ का निर्माण उन डीएनए खंडों को इकट्ठा करके किया जाता है जिन्हें वेक्टरों में क्लोन किया गया है ताकि रुचि के विशिष्ट डीएनए खंडों की पहचान और पृथक्करण आगे के अध्ययन के लिए किया जा सके। मूलतः दो प्रकार की डीएनए लाइब्रेरीज़ होती हैं (जीनोमिक और cDNA लाइब्रेरीज़) जिनका वर्णन निम्नलिखित खंड में किया गया है।

(i) जीनोमिक डीएनए लाइब्रेरी

एक जीनोमिक लाइब्रेरी डीएनए के छोटे टुकड़ों के क्लोनों का एक संग्रह है जो एक साथ किसी जीव के सम्पूर्ण जीनोम का प्रतिनिधित्व करते हैं। समान वेक्टरों की एक आबादी डीएनए सम्मिलित खंडों को संग्रहित करती है, जिनमें से प्रत्येक एक भिन्न सम्मिलित खंड रखता है। सामान्यतः, जीनोमिक लाइब्रेरी का निर्माण चित्र 3.20 में दिखाए अनुसार किया जाता है। पहले, स्रोत से जीनोमिक डीएनए को पृथक किया जाता है, जो वेक्टर में सम्मिलित होने के लिए बहुत बड़ा होता है और वांछनीय खंड आकारों में तोड़ा जाना आवश्यक होता है। इसलिए, जीनोमिक डीएनए को एक प्रतिबंधन एंजाइम से पचाया जाता है ताकि डीएनए को विशिष्ट आकार के खंडों में काटा जा सके। डीएनए खंडों को तब डीएनए लाइगेज का उपयोग कर वेक्टरों में सम्मिलित किया जाता है ताकि पुनः संयोजी वेक्टर बन सकें। यह पुनः संयोजी डीएनए अणुओं का एक पूल उत्पन्न करता है। पुनः संयोजी डीएनए अणुओं को अब मेजबान जीवाणु कोशिकाओं द्वारा रूपांतरण के माध्यम से ग्रहण कराया जाता है और फिर उन्हें एक पोषक माध्यम में गुणा करने के लिए छोड़ा जाता है ताकि कॉलोनियाँ बन सकें। सभी मेजबान कोशिकाएँ जो पुनः संयोजी वेक्टर रखती हैं, एक जीनोमिक लाइब्रेरी का प्रतिनिधित्व करती हैं। निर्मित लाइब्रेरी में किसी जीव के जीनोम में उपस्थित सभी डीएनए खंडों की प्रतिनिधि प्रतियाँ होती हैं।

चित्र 3.20: जीनोमिक लाइब्रेरी का निर्माण

जीनोमिक लाइब्रेरी का जैवप्रौद्योगिकी में कई अनुप्रयोग हैं। किसी प्रजाति की जीनोमिक लाइब्रेरी उसके सम्पूर्ण जीनोम के अनुक्रमण में सहायक हो सकती है। साथ ही, ऐसे कई जीनों की खोज की जा सकती है जो किसी जीव के जीनोम में अभिव्यक्त नहीं होते। यह प्रजातियों के विकास को समझने में भी सहायक है। जीनोमिक लाइब्रेरी का उपयोग किसी जीव के स्वस्थ और रोगग्रस्त ऊतकों के अनुक्रमों की तुलना करके जेनेटिक विसंगतियों की पहचान के लिए किया जा सकता है।

(ii) cDNA लाइब्रेरी

उच्च यूकैरियोट्स में जीन अभिव्यक्ति ऊतक-विशिष्ट होती है। विशिष्ट कोशिकाओं में कुछ जीन मध्यम से उच्च स्तर तक अभिव्यक्त होते हैं। उदाहरण के लिए, इंसुलिन प्रोटीन कोडित करने वाले जीन केवल अग्न्याशय की बीटा कोशिकाओं में अभिव्यक्त होते हैं जबकि एल्ब्यूमिन कोडित करने वाले जीन यकृत कोशिकाओं में अभिव्यक्त होते हैं। इस जानकारी का उपयोग करते हुए, किसी विशिष्ट ऊतक से mRNA को अलग करके लक्ष्य जीन को क्लोन किया जा सकता है। विशिष्ट cDNA अनुक्रमों को किसी विशिष्ट कोशिका प्रकार के mRNAs की प्रतिलिपियों के रूप में संश्लेषित किया जाता है जिसे cDNA (पूरक DNA) कहा जाता है। mRNAs की ऐसी DNA प्रतिलिपियों के क्लोनों को cDNA क्लोन कहा जाता है। किसी जीव के विशिष्ट कोशिका प्रकार या ऊतक में अभिव्यक्त सभी जीनों के cDNA क्लोन cDNA लाइब्रेरी का प्रतिनिधित्व करते हैं।

cDNA लाइब्रेरी की रचना में रुचि के कोशिका प्रकार या ऊतक से कुल mRNA के पृथक्करण शामिल होता है। mRNA एकल-सूत्री होने के कारण इस प्रकार क्लोन नहीं किया जा सकता और यह DNA लाइगेस के लिए सब्सट्रेट नहीं है। इसे पहले cDNA में परिवर्तित किया जाता है जिसे एक उपयुक्त वेक्टर में सम्मिलित किया जा सके, जो रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस (RNA-निर्भर DNA पॉलिमरेज़ या RTase) का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है। RTase mRNA को टेम्पलेट के रूप में उपयोग करके mRNA पर एक पूरक DNA सूत्र का संश्लेषण करता है। mRNA को तब RNase द्वारा हटा दिया जाता है और एकल-सूत्री

चित्र 3.21: cDNA लाइब्रेरी की रचना

cDNA को DNA पॉलिमरेज़ द्वारा द्वि-सूत्री cDNA में परिवर्तित किया जाता है। cDNA अणुओं को उपयुक्त होस्ट-वेक्टर प्रणाली में क्लोन किया जाता है (चित्र 3.21)। cDNA के कुल क्लोन स्रोत की cDNA लाइब्रेरी के प्रतिनिधि होते हैं। चूँकि जीनों की अभिव्यक्ति एक जीव के विभिन्न अंगों या कोशिकाओं में विभिन्न शारीरिक अवस्थाओं पर भिन्न होती है, एक जीव के विभिन्न स्रोतों से तैयार cDNA लाइब्रेरी एक-दूसरे से भिन्न हो सकती हैं।

cDNA लाइब्रेरी का जैवप्रौद्योगिकी के अनुप्रयोगों में बहुत महत्व है। cDNA लाइब्रेरी का सबसे महत्वपूर्ण अनुप्रयोग यह जानना है कि कौन-से जीन किसी विशेष ऊतक में किसी विशेष शारीरिक अवस्था के तहत सक्रिय हैं। यह हमें एक विशिष्ट जीन को पृथक करने में भी मदद करता है। cDNA को प्रोब के रूप में उपयोग करके, हम किसी विशेष जीन के लिए जीनोमिक लाइब्रेरी की स्क्रीनिंग कर सकते हैं।

सारांश

• विभिन्न जीवों से न्यूक्लिक अम्लों का पृथक्करण किसी भी आण्विक जीव विज्ञान प्रयोग के लिए सबसे आवश्यक आवश्यकता है। न्यूक्लिक अम्लों के निष्कर्षण की प्रक्रिया में चार चरण होते हैं अर्थात् जैविक नमूनों का विक्षोभ, न्यूक्लिक अम्लों को उसके अपघटनकारी एंजाइमों से सुरक्षा, अन्य अणुओं से न्यूक्लिक अम्लों का पृथक्करण और पृथक किए गए न्यूक्लिक अम्लों की शुद्धता और गुणवत्ता का मूल्यांकन।
• विभिन्न एंजाइम पुनःसंयोजक डीएनए (rDNA) प्रौद्योगिकी में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। ये हैं न्यूक्लिएसेज़, डीएनए लाइगेस, क्षारीय फॉस्फेटेज, पॉलीन्यूक्लियोटाइड काइनेज, पॉली ए पॉलीमरेज़ आदि।
• डीएनए के हेरफेर का प्रमुख कार्य वेक्टर डीएनए में रुचि के जीन को काटना और जोड़ना है।
• न्यूक्लिएसेज़ वे एंजाइम होते हैं जो न्यूक्लिक अम्लों को फॉस्फोडाइएस्टर बंध को हाइड्रोलाइज़ करके काटते हैं जो आसन्न न्यूक्लियोटाइडों की शर्करा अवशेषों को जोड़ता है। फॉस्फोडाइएस्टर बंधों पर इसकी क्रिया के आधार पर दो प्रमुख प्रकार के न्यूक्लिएसेज़ एंजाइम पहचाने गए हैं, जो हैं एक्सोन्यूक्लिएस और एंडोन्यूक्लिएस।
• एक्सोन्यूक्लिएस एंजाइम डीएनए अणु के 3’ या 5’ सिरे से मोनोन्यूक्लियोटाइड को हटा सकते हैं।
• एंडोन्यूक्लिएस एंजाइम डीएनए अणु को एक विशिष्ट अनुक्रम पर काटते हैं, इसलिए इन्हें प्रतिबंधन एंडोन्यूक्लिएस या प्रतिबंधन एंजाइम (REs) कहा जाता है। REs को मुख्यतः तीन समूहों (अर्थात् प्रकार I, II और III) में उनके सहकारक आवश्यकता और लक्ष्य अनुक्रम के सापेक्ष उनके डीएनए क्लीवेज स्थान के आधार पर वर्गीकृत किया गया है। प्रकार II REs का उपयोग rDNA प्रौद्योगिकी में होता है।
• डीएनए लाइगेस दो डीएनए स्ट्रैंडों को डुप्लेक्स रूप में फॉस्फोडाइएस्टर बंध के निर्माण को उत्प्रेरित करके एक साथ जोड़ सकता है।
• डीएनए पॉलीमरेज़ एंजाइमों का एक समूह होता है जो टेम्पलेट स्ट्रैंड पर dNTPs का उपयोग करके नए डीएनए स्ट्रैंड का संश्लेषण उत्प्रेरित करता है।
• क्षारीय फॉस्फेटेज का उपयोग डीएनए स्ट्रैंडों के 5’ सिरे से टर्मिनल फॉस्फेट समूह को हटाने के लिए किया जाता है।
• रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज का उपयोग एक आरएनए टेम्पलेट से पूरक डीएनए (cDNA) स्ट्रैंड उत्पन्न करने के लिए किया जाता है, इस प्रक्रिया को रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन कहा जाता है।
• rDNA प्रौद्योगिकी में, पुनःसंयोजक डीएनए को कई विधियों द्वारा होस्ट कोशिकाओं में प्रस्तुत (स्थानांतरित) किया जाता है, जैसे रासायनिक आधारित ट्रांस्फेक्शन (कैल्शियम क्लोराइड, लिपोफेक्शन आदि) और भौतिक ट्रांस्फेक्शन (इलेक्ट्रोपोरेशन, सूक्ष्मइंजेक्शन और बायोलिस्टिक) विधियाँ।
• रूपांतरित जीवाणुओं का चयन एक सफल क्लोनिंग प्रयोग के लिए सबसे आवश्यक चरण है अर्थात् रूपांतरित और अनरूपांतरित कोशिकाओं के मिश्रण से पुनःसंयोजक वेक्टर (रुचि के जीन के साथ) वाली रूपांतरित कोशिकाओं की पहचान करना। ये चयन विधियाँ प्रत्यक्ष या समावेशी निष्क्रियन के माध्यम से हो सकती हैं।
• प्रत्यक्ष चयन में, रूपांतरित कोशिकाओं को अनरूपांतरित कोशिकाओं से कुछ लक्षणों की अभिव्यक्ति के आधार पर अलग किया जाता है, जैसे प्रतिजीवी के प्रति प्रतिरोध।
• समावेशी निष्क्रियन विधि में, एक वेक्टर का उपयोग किया जाता है जिसमें दो मार्कर होते हैं (या तो दो प्रतिजीवी प्रतिरोधी जीन या एक प्रतिजीवी प्रतिरोधी जीन और lacZ जीन)।
• ब्लू-व्हाइट चयन विधि समावेशी निष्क्रियन का एक अन्य उदाहरण है जिसमें पुनःसंयोजक रूपांतरित कोशिकाओं का चयन किया जाता है जिसमें lacZ जीन की अभिव्यक्ति सीधे जीवाणु कॉलोनियों में देखी जा सकती है।
• ब्लॉटिंग तकनीकों का व्यापक रूप से डीएनए, आरएनए और प्रोटीन को अणुओं के मिश्रण से अलग करने और पहचानने के लिए उपयोग किया जाता है।
• सदर्न ब्लॉटिंग तकनीक डीएनए नमूनों में डीएनए की विशिष्ट अनुक्रम का पता लगाने के लिए उपयोग की जाती है।
• नॉर्दर्न ब्लॉटिंग तकनीक आरएनए के मिश्रण में विशिष्ट आरएनए अणुओं का पता लगाने के लिए उपयोग की जाती है।
• वेस्टर्न ब्लॉटिंग ऊतक समसेट या निष्कर्षण के नमूने में विशिष्ट प्रोटीन का पता लगाने के लिए उपयोग की जाती है।
• पॉलीमरेज़ चेन रिएक्शन (PCR) का उपयोग डीएएनए की थोड़ी मात्रा को हजारों से लाखों प्रतियों में प्रवर्धित करने के लिए किया जाता है, जिसमें तीन चरण होते हैं अर्थात् विकृतीकरण, ऐनिलिंग और विस्तार। PCR के प्रवर्धित उत्पाद का विश्लेषण अभिक्रिया के अंत में जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा किया जा सकता है (अंत बिंदु विश्लेषण)।
• PCR प्रौद्योगिकी में नवीनतम प्रगति रियल-टाइम मात्रात्मक PCR (qPCR) है, जिसमें फ्लोरोसेंट मार्करों का उपयोग किया जाता है जिनकी द्विगुणित डीएनए से विशिष्ट बंधन आकर्षण होता है। qPCR में, पारंपरिक PCR के विपरीत जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस की आवश्यकता नहीं होती है।
• डीएनए पुस्तकालयों का निर्माण डीएनए खंडों को एकत्र करके किया जाता है जिन्हें वेक्टरों में क्लोन किया गया हो ताकि रुचि के विशिष्ट डीएनए खंडों की पहचान और पृथक्करण किया जा सके। मूलतः दो प्रकार के डीएनए पुस्तकालय होते हैं - जीनोमिक और cDNA पुस्तकालय।
• जीनोमिक पुस्तकालय डीएनए के छोटे खंडों के क्लोनों का एक संग्रह होता है जो मिलकर किसी जीव के सम्पूर्ण जीनोम का प्रतिनिधित्व करते हैं।
• cDNA पुस्तकालय किसी जीव की विशिष्ट कोशिका प्रकार या ऊतक में अभिव्यक्त सभी जीनों के cDNA क्लोनों का निर्माण करता है।

अभ्यास

1. डीएनए के पृथक्करण के लिए प्रयुक्त विधियों का वर्णन कीजिए।

2. न्यूक्लिक अम्ल के पृथक्करण की प्रक्रिया में जैविक अपमार्जक की भूमिका क्या है?

3. पादप ऊतक से डीएनए पृथक्करण जीवाणु कोशिका से किस प्रकार भिन्न होता है?

4. प्रतिबंधन एंजाइमों (REs) के कितने प्रकार होते हैं? क्या सभी REs rDNA प्रौद्योगिकी में प्रयुक्त किए जा सकते हैं? औचित्य दीजिए।

5. न्यूक्लिक अम्द निष्कर्षण की प्रक्रिया के दौरान किन चुनौतियों का सामना किया जाता है?

6. rDNA प्रौद्योगिकी में क्षारीय फॉस्फेटेज, डीएनए लाइगेज, टर्मिनल ट्रांस्फरेज की भूमिका लिखिए।

7. डीएनए निष्कर्षण की प्रक्रिया में किलेटिंग एजेंट की भूमिका का वर्णन कीजिए।

8. डीएनए को मेज़बान में स्थानांतरित करने की विधियों का संक्षेप में वर्णन कीजिए।

9. ब्लू-व्हाइट चयन विधि के लिए सही कथन की पहचान कीजिए।

(a) जीवाणु कॉलोनी को रंगने के लिए एक विशिष्ट रंगक का प्रयोग किया जाता है।

(b) यह lacZ जीन की अभिव्यक्ति पर आधारित है।

(c) पुनःसंयोजक जीवाणु कॉलोनी नीली रहती है।

(d) lacZ जीन को एक प्रतिरोधी जीवाणु जीन में सम्मिलित किया जाता है।

10. निम्नलिखित विकल्पों में से सही सुमेलित युग्म की पहचान कीजिए।

(a) नॉर्दर्न ब्लॉट: डीएनए की विशिष्ट अनुक्रम का पता लगाना

(b) सदर्न ब्लॉट: आरएनए की विशिष्ट अनुक्रम का पता लगाना

(c) वेस्टर्न ब्लॉट: विशिष्ट प्रोटीनों का पता लगाना

(d) ईस्टर्न ब्लॉट: आरएनए में प्रतिलेखन संशोधनों का पता लगाना

11. निम्नलिखित विकल्पों में से गलत सुमेलित युग्म की पहचान कीजिए।

(a) टैक पॉलिमरेज़: थर्मस एक्वाटिकस

(b) पीएफयू पॉलिमरेज़: पाइरोकोकस फ्यूरियोसस

(c) हिन्डIII: हीमोफिलस इन्फ्लुएंज़ी

(d) पीएसटीआई: पाइरोकोकस स्टुअर्टी

12. पुनर्संयोजकों (recombinants) की जाँच कैसे की जाती है? विधियों का विस्तार से वर्णन कीजिए।

13. सदर्न, नॉर्दर्न और वेस्टर्न ब्लॉटिंग के बीच अंतर बताइए।

14. PCR क्या है? विस्तार से वर्णन कीजिए।

15. जीनोमिक और cDNA लाइब्रेरी की तुलनात्मक व्याख्या लिखिए।

16. डिप्लॉयड मानव जीनोम में होता है:

(a) $3.2 \times 10^{9}$ बेस युग्म

(b) $6.4 \times 10^{8}$ बेस युग्म

(c) $3.2 \times 10^{8}$ बेस युग्म

(d) $6.4 \times 10^{9}$ बेस युग्म

17. निम्नलिखित में से गलत सुमेलित युग्म का चयन कीजिए।

(a) न्यूक्लिएसेज़ : फॉस्फोडाइएस्टर बंध को जल-अपघटित करते हैं

(b) प्रतिबंधक एंजाइम : विशिष्ट अनुक्रम पर DNA को काटते हैं

(c) पैलिन्ड्रोमिक अनुक्रम : उल्टे और सीधे एक समान पढ़ा जाता है

(d) EcoRI: प्रकार I प्रतिबंधक एंजाइम

18. अभिकथन: PCR का उपयोग बहुत थोड़ी मात्रा में DNA को DNA संशोधित करने वाले एंजाइमों का उपयोग करके प्रवर्धित करने के लिए किया जा सकता है।

कारण: PCR Taq पॉलिमरेज़ का उपयोग करता है।

(a) अभिकथन और कारण दोनों सत्य हैं और कारण अभिकथन का सही स्पष्टीकरण है।

(b) अभिकथन और कारण दोनों सत्य हैं लेकिन कारण अभिकथन का सही स्पष्टीकरण नहीं है।

(c) अभिकथन सत्य है लेकिन कारण असत्य है।

(d) अभिकथन और कारण दोनों असत्य हैं।

19. अभिकथन: विदेशी जीन को होस्ट जीवाणु में विद्युत-भारित परिवर्तन (electroporation) जैसी रूपांतरण तकनीकों द्वारा प्रस्तुत किया जा सकता है।

कारण: जीवाणुओं में कोशिका भित्ति/झिल्ली होती है।

(a) अभिकथन और कारण दोनों सत्य हैं और कारण अभिकथन का सही स्पष्टीकरण है।

(b) दोनों कथन और कारण सत्य हैं, लेकिन कारण कथन का सही स्पष्टीकरण नहीं है।

(c) कथन सत्य है, लेकिन कारण असत्य है।

(d) दोनों कथन और कारण असत्य हैं।