सूक्ष्मजीवों की दुनिया में उनकी संरचना, कार्य, आवास और अनुप्रयोगों से संबंधित असाधारण विविधता है। वे प्रकृति में सर्वव्यापी हैं, अर्थात् वे हर जगह मौजूद हैं। सूक्ष्म जीव विज्ञान (Microbiology) छोटे (micro) जीवों (bios) के अध्ययन या विज्ञान (logos) है। सूक्ष्म जीव विज्ञान ने मौलिक अनुसंधान, कृषि, फार्मास्यूटिकल उद्योग, चिकित्सा, पर्यावरण विज्ञान, खाद्य प्रौद्योगिकी, आनुवंशिक इंजीनियरिंग आदि में प्रमुख स्थान प्राप्त कर लिया है। इस अध्याय में आप सूक्ष्मजीवों के पोषण, कल्चर मीडिया, निर्जीवीकरण तकनीकों और वृद्धि वक्र के बारे में सीखेंगे।

6.1 ऐतिहासिक परिप्रेक्ष्य

1600 के दशक के मध्य में सूक्ष्मदर्शी (microscope) की खोज ने सूक्ष्म जीव विज्ञान की नींव रखी। 1670 के दशक से 1680 के दशक तक, एक डच व्यापारी, एंटोन वान ल्यूवेनहुक ने सूक्ष्मदर्शी विकसित किया और सूक्ष्म जीवों का अवलोकन किया तथा ‘एनिमलक्यूल्स’ शब्द गढ़ा। एंटोन वान ल्यूवेनहुक के युग के बाद, सूक्ष्मदर्शियों की दुर्लभ उपलब्धता और सूक्ष्मजीवों के प्रति रुचि की कमी के कारण सूक्ष्म जीव विज्ञान का विकास धीमा रहा। उस समय के वैज्ञानिकों का मानना था कि सूक्ष्मजीव निर्जीव पदार्थ से उत्पन्न होते हैं। लेकिन दूसरी ओर, लाज़्ज़ारो स्पल्लान्ज़ानी ने देखा कि उबले हुए शोरबा में जीवन के कोई सूक्ष्म रूप नहीं थे। 1800 के दशक के मध्य और अंत में, लुई पास्चर ने प्रतिदिन के जीवन में सूक्ष्मजीवों के महत्व को सिद्ध करने के लिए प्रयोग किए और वैज्ञानिकों को मानव रोगों में जीवाणुओं की भूमिका के बारे में सोचने के लिए प्रेरित किया।

बॉक्स 1

रोगों की जीवाणु-सिद्धांत (germ theory of disease) की अवधारणा को दर्शाता हुआ लुई पाश्चर का प्रयोग। (गर्दन की अनोखी बनावट हवा को फ्लास्क में आने देती थी, परन्तु कवक-बीजाणुओं और जीवाणुओं के प्रवेश को रोकती थी)

पाश्चर ने उबले हुए झोल को हवा के सम्पर्क में ऐसे फिल्टरयुक्त फ्लास्कों में रखा जिससे सभी कण वृद्धि-माध्यम तक न पहुँच सकें। उसने कुछ झोल ऐसे फ्लास्कों में भी डाले जिनकी लम्बी टेढ़ी-मेढ़ी ‘S’ आकृति की गर्दन धूल के कणों को अन्दर जाने नहीं देती थी। उसने देखा कि झोल में कुछ भी नहीं उगता [चित्र (a)]। फिर उसने फ्लास्क की लम्बी गर्दन को तोड़ दिया और जीवाणुओं की वृद्धि दिखाई दी [चित्र (b)]। उसने फ्लास्क को तिरछा करके झोल को गर्दन से छूने दिया, जिससे झोल बाह्य वातावरण के सम्पर्क में आ गया। कुछ समय बाद उसने जीवाणुओं की वृद्धि देखी [चित्र (c)]। ये [चित्र (b) और (c)] सिद्ध करते हैं कि ऐसे झोलों में जीवित जीव बाहर से आने वाले कारकों के कारण उगते हैं, न कि स्वतः उत्पन्न होते हैं। इस प्रकार उसके अग्रणी कार्य ने यह सिद्ध किया कि सूक्ष्मजीव वायु में मौजूद होते हैं और रोग उत्पन्न कर सकते हैं। अपने प्रयोगों के आधार पर पाश्चर ने स्वतः-उत्पत्ति (spontaneous generation) के सिद्धांत को खारिज किया और रोगों के जीवाणु-सिद्धांत को प्रतिपादित किया, जो कहता है कि संक्रामक रोगों का कारण सूक्ष्मजीव होते हैं।

जर्मन वैज्ञानिक रॉबर्ट कोच ने बेसिली की शुद्ध संस्कृतियों को चूहों में इंजेक्ट कर यह सिद्ध किया कि बेसिली एन्थ्रेक्स का कारण बनती हैं। तदनुसार, कोच ने कल्पित नियम (चित्र 6.1) प्रस्तुत किए और सिद्धांतों का एक समूह दिया जिससे सूक्ष्मजीवों को रोगों के कारणकारी एजेंट माना गया। इस प्रकार कोच ने निम्नलिखित परिकल्पना की:

• सूक्ष्मजीव सभी रोगग्रस्त जीवों में प्रचुर मात्रा में उपस्थित होना चाहिए, परंतु स्वस्थ जीवों में उपस्थित नहीं होना चाहिए।
• सूक्ष्मजीव को रोगग्रस्त जीव से पृथक् कर शुद्ध संस्कृति में उगाया जाना चाहिए।
• संस्कृत सूक्ष्मजीव को जब स्वस्थ जीव में प्रस्तुत किया जाए तो उसे रोग उत्पन्न करना चाहिए।
• सूक्ष्मजीव को इनोक्युलेट, रोगग्रस्त प्रायोगिक मेज़बान से पुनः पृथक् करना चाहिए और मूल विशिष्ट कारणकारी एजेंट के समरूप पहचाना जाना चाहिए।

चित्र 6.1: कोच के प्रयोगों की चित्रात्मक प्रस्तुति

सूक्ष्मजीव विज्ञान के विकास के दौरान, पास्चर और कोच के सुझावों के आधार पर, 1800 के दशक के अंत और 1900 के दशक के प्रारंभिक वर्षों को सूक्ष्मजीव विज्ञान का स्वर्ण युग कहा जाता है। इस अवधि के दौरान सूक्ष्मजीव रोगों के विभिन्न कारणकारी एजेंटों की खोज हुई।

$19^{\text {वीं}}$ सदी में, जीवाणुशास्त्रियों ने सूक्ष्मजीवों को बढ़ाने के लिए भोजन या पदार्थ के उपयोग का प्रयास किया। 1860 में, लुई पाश्चर ने एक माध्यम का उपयोग किया जिसमें खमीर, राख और अमोनियम लवण थे। इस माध्यम में सूक्ष्मजीव वृद्धि के लिए आवश्यक मूल पोषक तत्व थे, जैसे कार्बन स्रोत (जैसे चीनी), नाइट्रोजन (जैसे अमोनियम लवण), और विटामिन (जैसे राख)। अधिक बहुपयोगी आधारभूत माध्यम विकसित करने के लिए, फर्डिनेंड कोह्न ने पाश्चर के माध्यम को विभिन्न प्रकार की चीनी वेरिएट करके और अधिक परिष्कृत बनाया। रॉबर्ट कोच ने देखा कि ताजा बीफ सीरम या मांस अर्क पर आधारित ब्रॉथ इष्टतम वृद्धि के लिए उपयोग किए जा सकते हैं।

ठोस माध्यम के द्रव माध्यम के स्थान पर प्रयोग ने भी जीवाणु विज्ञान के विकास में एक महत्वपूर्ण मील का पत्थर सिद्ध किया। 1881 में, रॉबर्ट कोच ने शुद्ध संस्कृतियों के पृथक्करण के लिए शोरबा माध्यम के प्रयोग में आने वाली कठिनाइयों को पहचाना और ठोस माध्यम विकल्पों के प्रयोग पर विचार किया। बेसिलस एन्थ्रेसिस के पृथक्करण के दौरान, कोच ने जमे हुए अंडे के एल्बुमिन, स्टार्च पेस्ट और आलू के एक बाँझ कटे टुकड़े के साथ माध्यम का मूल्यांकन किया, लेकिन यह रोगजनक जीवाणुओं की वसूली में अपेक्षाकृत कमजोर सिद्ध हुआ। उसके बाद, कोच ने मांस अर्क और जिलेटिन (त्वचा और हड्डियों के कोलेजन से प्राप्त) के साथ माध्यम को और विकसित किया। विकास के दौरान, अंततः जिलेटिन की जगह अगर ने ले लिया, क्योंकि अगर सूक्ष्म जीव विज्ञान माध्यम के लिए आवश्यक ठोस सहायता प्रदान करता है, लेकिन यह जीवाणुओं के विकास के लिए आवश्यक पोषक तत्व नहीं देता। ठोस माध्यम पर जीवाणुओं की वृद्धि के प्रेक्षण के आधार पर, कोच ने ‘कॉलोनी’ शब्द गढ़ा ताकि शुद्ध और पृथक वृद्धि का वर्णन किया जा सके।

सूक्ष्म जीव संस्कृति में सुधार के लिए एक महत्वपूर्ण विकास 1887 में हुआ, जब जूलियस रिचर्ड पेट्री ने समतल काँच की प्लेट (प्रयोगशालाओं में सामान्य) को संशोधित किया और माध्यम के लिए एक नए प्रकार की संस्कृति डिश का प्रयोग करना शुरू किया, जिसे पेट्री डिश कहा गया। यह एक उथली गोलाकार काँच की डिश है जिसमें ढीले ढक्कन के साथ वृद्धि माध्यम को रखा जाता है। इसने संस्कृति की स्थितियों को सुधारने में मदद की और आज यह सूक्ष्म जीव संस्कृतियों के लिए सबसे अधिक प्रयोग की जाने वाली प्लेटों में से एक है।

$19^{\text {वीं}}$ सदी के दौरान प्रयोग किए जाने वाले अधिकांश माध्यम गैर-चयनात्मक थे और इन्हें विभिन्न प्रकार के जीवाणुओं की वृद्धि के लिए डिज़ाइन किया गया था। $20^{\text {वीं}}$ सदी की शुरुआत में, कल्चर माध्यमों में और अधिक प्रगति हुई। मार्टिनस बेइजरिन्क ने नाइट्रोजनीय यौगिकों से रहित एक माध्यम विकसित किया जिसका उपयोग रूट नोड्यूल जीवाणु राइज़ोबियम को अलग करने के लिए किया गया, जिससे नाइट्रोजन स्थिर न करने वाले सूक्ष्मजीवों की वृद्धि रुक गई और राइज़ोबियम की शुद्ध संस्कृति को अलग करने में मदद मिली। फिर, कुछ सूक्ष्मजीवों की अनॉक्सी परिस्थितियों में $\mathrm{CO}_{2}$ को कार्बन स्रोत के रूप में उपयोग करने की क्षमता के आधार पर, बेइजरिन्क (1904) ने एक अन्य चयनात्मक माध्यम विकसित किया जिससे सल्फर-ऑक्सीडाइज़िंग जीवाणु थायोबेसिलस डिनाइट्रिफिकन्स की शुद्ध संस्कृति को अलग किया जा सका। माध्यम निर्माण में हुई कुछ महत्वपूर्ण प्रगतियाँ इस प्रकार हैं:

• अल्फ्रेड थियोडोर मैककोन्की (1905) ने मल नमूनों में लैक्टोज किण्वित करने वाले जीवाणुओं का चयन करने के लिए बाइल लवणों का उपयोग किया।
• चर्चमैन (1912) ने दिखाया कि ट्राइफ़ेनिलमेथेन के व्युत्पन्न, जैसे जेंशियन वायलेट और ब्रिलियंट ग्रीन रंग, विशेष रूप से ग्राम पॉजिटिव जीवाणुओं के लिए निरोधक थे।
• मुलर (1923) ने आयोडीन और सोडियम थायोसल्फेट (जो मिलकर टेट्राथायोनेट बनाते हैं) का उपयोग करते हुए एक माध्यम का वर्णन किया जिससे उस जीव का चयन किया जा सके जिसमें एंजाइम टेट्राथायोनेज़ होता है।

1930 के दशक तक, शोधकर्ताओं ने जीवाणु पोषण पर वृद्धि कारकों के महत्व पर विचार करना शुरू किया। 1940 के दशक में, इलेक्ट्रॉन सूक्ष्मदर्शी के आविष्कार के साथ, वायरसों के अध्ययन और संवर्धन विधियाँ प्रस्तुत की गईं, और वायरसों के बारे में ज्ञान तेजी से विकसित हुआ। 1950 के दशक तक, जीवाणु वृद्धि में सह-एंजाइमों की क्रियाविधि उपयोगी पाई गई। एक अन्य महत्वपूर्ण विकास माध्यमों में एंटीबायोटिक्स के उपयोग था और 1960 के दशक तक, संवर्धन माध्यमों में एंटीबायोटिक्स का उपयोग चयनात्मक एजेंटों के रूप में किया जाने लगा।

द्वितीय विश्व युद्ध के बाद, सूक्ष्म जीव विज्ञान की आगे की उन्नति ने एंटीबायोटिक्स को विभिन्न रोगों—जैसे निमोनिया, क्षय रोग, मेनिन्जाइटिस, सिफलिस आदि—के लिए औषधि के रूप में खोजने की ओर अग्रसर किया। 1950 और 1960 के दशकों की अवधि के दौरान, पोलियो, खसरा, कण्ठमाला और रूबेला जैसे वायरल रोगों के खिलाफ कई टीके विकसित किए गए।

आधुनिक सूक्ष्म जीव विज्ञान के विभिन्न क्षेत्रों में अनुप्रयोग हैं, जैसे फार्मास्युटिकल उत्पादों का विकास, खाद्य और डेयरी उत्पाद, रोग-कारक सूक्ष्मजीवों का नियंत्रण, और सूक्ष्मजीवों का औद्योगिक दोहन। इस प्रकार, सूक्ष्मजीवों का उपयोग विटामिन, अमीनो अम्ल, एंजाइम, वृद्धि पूरक तथा विभिन्न खाद्य पदार्थ—जैसे किण्वित डेयरी उत्पाद (खट्टी मलाई और छाछ), अचार, ब्रेड और मादक पेय—उत्पन्न करने के लिए किया गया।

जैव प्रौद्योगिकी में, लागू सूक्ष्म जीव विज्ञान का एक प्रमुख भूमिका है क्योंकि सूक्ष्म जीवों का उपयोग जीवित कारखानों के रूप में किया जाता है ताकि फार्मास्यूटिकल्स का उत्पादन किया जा सके, जिनमें मानव हार्मोन इंसुलिन, प्रतिरोधी वायरल प्रोटीन इंटरफेरॉन, कई रक्त-थक्का बनाने वाले कारक और थक्का घोलने वाले एंजाइम, साथ ही कई वैक्सीन शामिल हैं। rDNA प्रौद्योगिकी के लिए, आनुवंशिक रूप से इंजीनियर्ड सूक्ष्म जीवों का उपयोग होस्ट वेक्टर के रूप में किया जाता है ताकि आनुवंशिक रूप से संशोधित जीवों (GMOs) को बेहतर लक्षणों के साथ विकसित किया जा सके।

सूक्ष्म जीवों की पोषण श्रेणियाँ

सूक्ष्म जीवों को उनके कार्बन और ऊर्जा प्राप्त करने के साधन के आधार पर वर्गीकृत किया जा सकता है। अधिकांश सूक्ष्म जीव अपना कार्बन कार्बनिक अणुओं के रूप में प्राप्त करते हैं, जो सीधे या परोक्ष रूप से अन्य जीवों से प्राप्त होते हैं, और इन्हें हेटरोट्रॉफ कहा जाता है जिनमें सभी कवक और प्रोटोजोआ, साथ ही बैक्टीरिया के अधिकांश प्रकार शामिल हैं। सूक्ष्म जीव जो अपना कार्बन कार्बन डाइऑक्साइड से प्राप्त करते हैं उन्हें ऑटोट्रॉफ कहा जाता है जिनमें महत्वपूर्ण संख्या में बैक्टीरिया और लगभग सभी शैवाल शामिल हैं।

ऑटोट्रॉफ आगे दो श्रेणियों के हो सकते हैं। केमोऑटोट्रॉफ अपनी ऊर्जा और कार्बन दोनों अकार्बनिक स्रोतों से प्राप्त करते हैं (अकार्बनिक अणुओं, जैसे सल्फर या नाइट्राइट के ऑक्सीकरण द्वारा), जबकि फोटोऑटोट्रॉफ में प्रकाश संश्लेषी रंजक होते हैं और वे उनका उपयोग प्रकाश ऊर्जा को रासायनिक ऊर्जा में बदलने के लिए करते हैं।

अधिकांश विषमपोषी (heterotrophs) ऊर्जा कार्बनिक पोषक अणुओं के रासायनिक ऑक्सीकरण द्वारा प्राप्त करते हैं, इसलिए इन्हें रसायन-विषमपोषी (chemoheterotrophs) कहा जाता है। यद्यपि कुछ विषमपोषी (जैसे हरी और बैंगनी गैर-गंधक जीवाणु) प्रकाश संश्लेषण से प्रकाश ऊर्जा प्राप्त करते हैं, वे कार्बन कार्बनिक पोषक पदार्थों से लेते हैं, इसलिए इन्हें प्रकाश-विषमपोषी (photoheterotrophs) कहा जाता है। एक लिथोट्रॉफ (lithotroph) वह जीव है जो अकार्बनिक अणुओं, जैसे $\mathrm{H}{2} \mathrm{O}, \mathrm{H}{2} \mathrm{~S}$ या अमोनिया, को इलेक्ट्रॉन स्रोत के रूप में उपयोग करता है, जबकि एक ऑर्गेनोट्रॉफ (organotroph) इसी उद्देश्य के लिए कार्बनिक अणुओं का उपयोग करता है।

6.2 पोषण संबंधी आवश्यकताएँ और संवर्धन माध्यम (Culture MEDIA)

सूक्ष्मजीवों को ऊर्जा उत्पादन के साथ-साथ उनकी वृद्धि और गुणन के लिए आवश्यक पोषक तत्वों की आवश्यकता होती है। कार्बन, ऑक्सीजन, हाइड्रोजन, नाइट्रोजन, सल्फर, फॉस्फोरस, पोटैशियम, कैल्शियम, मैग्नीशियम और आयरन को मैक्रोन्यूट्रिएंट्स कहा जाता है और इनकी अपेक्षाकृत बड़ी मात्रा में आवश्यकता होती है। इनमें से C, O, H, N, S और P कार्बोहाइड्रेट, लिपिड्स, प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड के घटक होते हैं, और $\mathrm{K}, \mathrm{Ca}, \mathrm{Mg}$, Fe विभिन्न एंजाइमों के सहकारक के रूप में शामिल होकर विविध भूमिकाएं निभाते हैं। मैक्रोन्यूट्रिएंट्स के अलावा, कुछ माइक्रोन्यूट्रिएंट्स या ट्रेस तत्व, जैसे $\mathrm{Mn}, \mathrm{Zn}$, $\mathrm{Co}, \mathrm{Mo}, \mathrm{Ni}$, और $\mathrm{Cu}$ भी सूक्ष्मजीवों की वृद्धि के लिए छोटी मात्रा में आवश्यक होते हैं। ये माइक्रोन्यूट्रिएंट्स प्रकृति में सर्वव्यापी होते हैं और विभिन्न नियमित मीडिया घटकों के साथ पहले से मौजूद होते हैं, इसलिए इन्हें आमतौर पर अलग से आपूर्ति नहीं की जाती है। आवश्यक पोषक तत्वों को पोषक मीडिया के रूप में आपूर्ति करनी होती है। माध्यम के लिए आवश्यक प्रमुख घटक इस प्रकार हैं:

(क) कार्बन स्रोत: कार्बन सभी कार्बनिक अणुओं के कंकाल या रीढ़ के लिए आवश्यक होता है, और कार्बन स्रोत सामान्यतः ऑक्सीजन और हाइड्रोजन परमाणु भी प्रदान करते हैं। सूक्ष्मजीव कल्चर मीडिया में विविध कार्बन स्रोतों का उपयोग किया जाता है। उदाहरण के लिए, ग्लूकोज, लैक्टोज, सुक्रोज, स्टार्च, ग्लाइकोजन, सेल्युलोज, विभिन्न कार्बोहाइड्रेट्स का मिश्रण, जैसे सिरियल अनाज पाउडर, गन्ने की मोलासेस, आदि।

(b) नाइट्रोजन, फॉस्फोरस और सल्फर स्रोत: नाइट्रोजन स्रोत अमीनो अम्ल, न्यूक्लिक अम्ल, एंजाइम आदि के जैवसंश्लेषण के लिए आवश्यक होता है। अमोनियम लवण, यूरिया, पशु ऊतक अर्क, अमीनो अम्ल मिश्रण और पौधे-ऊतक अर्क मुख्य नाइट्रोजन स्रोत हैं जिन्हें संवर्धन माध्यम में प्रयोग किया जाता है। फॉस्फोरस न्यूक्लिक अम्ल, फॉस्फोलिपिड्स, न्यूक्लियोटाइड्स, कई कोफैक्टर्स और अन्य कोशिकीय घटकों में उपस्थित होता है। लगभग सभी सूक्ष्मजीव अपने फॉस्फोरस स्रोत के रूप में अकार्बनिक फॉस्फेट का उपयोग करते हैं। सल्फर विभिन्न अमीनो अम्लों, जैसे सिस्टीन और मेथियोनिन, कुछ कार्बोहाइड्रेट्स आदि के जैवसंश्लेषण के लिए आवश्यक होता है। अधिकांश सूक्ष्मजीव सल्फर के स्रोत के रूप में सल्फेट का उपयोग करते हैं।

(c) वृद्धि कारक: वृद्धि कारक कार्बनिक यौगिक होते हैं (जैसे कुछ अमीनो अम्ल, प्यूरीन्स और पिरिमिडिन्स और विटामिन) जिन्हें कोशिकाओं में संश्लेषित नहीं किया जा सकता और जो कोशिकाओं की वृद्धि और गुणन के लिए आवश्यक होते हैं।

(d) एंटी-फोम: एंटी-फोम पोषक घटक नहीं होते हैं। हालांकि, माध्यम में पोषक घटक जिनमें स्टार्च, प्रोटीन और अन्य कार्बनिक यौगिक शामिल हैं साथ ही कोशिका वृद्धि के दौरान बने उत्पाद, संवर्धन माध्यम की हिलाने-झुलाने के कारण अत्यधिक फेन उत्पन्न कर सकते हैं। इस फेन के निर्माण को रोकने के लिए, माध्यम में कुछ एंटी-फोमिंग एजेंट जैसे जैतून का तेल, सूरजमुखी का तेल और सिलिकॉन शामिल किए जाते हैं।

(इ) जल: जल किसी भी कल्चर माध्यम (द्रव या ठोस) का एक आवश्यक घटक/आधार होता है। ठोस कल्चर माध्यम में प्रयुक्त जल की मात्रा तुलनात्मक रूप से द्रव माध्यम से कम होती है।

एक कल्चर माध्यम में सभी पोषक तत्व, वृद्धि कारक, ऊर्जा स्रोत आदि होते हैं, जो सूक्ष्मजीवों की वृद्धि का समर्थन करते हैं।

यद्यपि सभी सूक्ष्मजीवों को ऊर्जा, कार्बन, नाइट्रोजन, फॉस्फोरस, सल्फर और विभिन्न खनिजों के स्रोतों की आवश्यकता होती है, उपयुक्त माध्यम की विशिष्ट संरचना उस विशेष प्रजाति पर निर्भर करेगी जिसे प्रयोगशाला में उगाया जाना है। इस प्रकार, सूक्ष्मजीव के लिए उपयुक्त कल्चर माध्यम चुनने के लिए सूक्ष्मजीव के आवास का पूर्व ज्ञान उपयोगी होता है, क्योंकि इसके पोषक आवश्यकताएं इसके प्राकृतिक परिवेश पर आधारित होती हैं।

माध्यमों के प्रकार

(A) रासायनिक संरचना के आधार पर, कल्चर माध्यमों को दो प्रकारों में वर्गीकृत किया गया है:

(i) संश्लेषित या रासायनिक रूप से परिभाषित माध्यम

ऐसे माध्यम जिनमें सभी रासायनिक घटक ज्ञात होते हैं, उन्हें परिभाषित माध्यम या संश्लेषित माध्यम कहा जाता है। कुछ सूक्ष्मजीव, विशेष रूप से प्रकाश-पाषाणजीवी स्वपोषी (जैसे सायनोबैक्टीरिया), को एक ऐसे माध्यम पर संवर्धित किया जा सकता है जिसमें कार्बन स्रोत के रूप में $\mathrm{CO}_{2}$, नाइट्रेट या अमोनिया को नाइट्रोजन स्रोत के रूप में, सल्फेट, फॉस्फेट और कई खनिज शामिल होते हैं। विभिन्न प्रकार के विषमपोषियों को ग्लूकोज को कार्बन स्रोत और अमोनियम लवण को नाइट्रोजन स्रोत के रूप में वाले माध्यम में संवर्धित किया जा सकता है। परिभाषित माध्यम व्यापक रूप से अनुसंधान में उपयोग किए जाते हैं और प्रयोगात्मक सूक्ष्मजीव की आवश्यकताओं के अनुसार विभिन्न घटकों को मिलाकर तैयार किए जाते हैं। M9 माध्यम का उपयोग एस्चेरिचिया कोलाई (E. coli) संवर्धन और रखरखाव के लिए व्यापक रूप से किया जाता है, और BG11 माध्यम का उपयोग नील-हरित शैवाल (सायनोबैक्टीरिया) के संवर्धन और रखरखाव के लिए किया जाता है।

(ii) जटिल माध्यम

ऐसे माध्यम जिनमें कुछ घटकों की रासायनिक संरचना अज्ञात होती है, उन्हें जटिल माध्यम कहा जाता है। ये माध्यम उपयोगी होते हैं, क्योंकि एक ही जटिल माध्यम में लगभग वे सभी पोषक तत्व हो सकते हैं जो विभिन्न सूक्ष्मजीवों की पोषण संबंधी आवश्यकताओं को पूरा करते हैं। जटिल माध्यम में अपरिभाषित घटक पेप्टोन, बीफ़ एक्सट्रैक्ट, यीस्ट एक्सट्रैक्ट आदि होते हैं। पेप्टोन प्रोटीन हाइड्रोलाइज़ेट होते हैं जो मांस, केसिन, जिलेटिन और अन्य प्रोटीन स्रोतों के आंशिक प्रोटियोलिसिस द्वारा तैयार किए जाते हैं और कार्बन, ऊर्जा और नाइट्रोजन के स्रोत के रूप में कार्य करते हैं। बीफ़ एक्सट्रैक्ट और यीस्ट एक्सट्रैक्ट क्रमशः बीफ़ और ब्रूवर’s यीस्ट के जलीय अर्क होते हैं। बीफ़ एक्सट्रैक्ट में अमीनो अम्ल, पेप्टाइड, न्यूक्लियोटाइड, कार्बनिक अम्ल, विटामिन और खनिज होते हैं, जबकि यीस्ट एक्सट्रैक्ट विटामिन, नाइट्रोजन और कार्बन यौगिकों का समृद्ध स्रोत होता है। उदाहरण हैं न्यूट्रिएंट ब्रॉथ, ट्रिप्टिक सोया ब्रॉथ और मैककोनकी ऐगर। लूरिया-बर्टानी (LB माध्यम) जीवाणुओं, जैसे E. coli को संवर्धित करने के लिए सामान्यतः प्रयुक्त माध्यम है। LB माध्यम, जिसे पहली बार ग्यूसेप्पे बर्टानी (1951) ने विकसित किया था, में $10 %$ ट्रिप्टोन/पेप्टोन, $5 %$ यीस्ट एक्सट्रैक्ट और $10 %$ सोडियम क्लोराइड होता है। पोटैटो डेक्सट्रोज़ ऐगर (PDA) विभिन्न कवकों, जिनमें यीस्ट और झिल्लीदार कवक शामिल हैं, की पहचान, संवर्धन और गणना के लिए प्रयुक्त होता है।

(B) स्थिरता के आधार पर संवर्धन माध्यम तीन प्रकार के होते हैं

(i) द्रव माध्यम या ब्रॉथ

द्रव माध्यम में, अगर नहीं डाला जाता है। अंतःक्षेपण और पश्चात् ऊष्मायन के बाद, कोशिकाओं की वृद्धि ब्रॉथ में दिखाई देने लगती है।

(ii) ठोस माध्यम

सूक्ष्मजीवों की सतह पर उगाने के लिए, ठोस संवर्धन माध्यम आवश्यक होता है। ठोस माध्यम तैयार करने के लिए, द्रव माध्यम में $1.0-2.0 %$ अगर मिलाकर उसे जमाया जाता है। अगर एक सल्फेटेड बहुलक है जो D-गैलेक्टोज़, 3,6-एनहाइड्रो-L-गैलेक्टोज़ और D-ग्लूक्यूरोनिक अम्ल से बना होता है, और सामान्यतः लाल शैवाल से निकाला जाता है। ठोस माध्यम का उपयोग अगर स्लांट, ढलान और अगर स्टैब बनाने के लिए किया जाता है। अगर को जमाने वाले एजेंट के रूप में प्राथमिकता दी जाती है क्योंकि अधिकांश सूक्ष्मजीव इसे विघटित नहीं कर सकते। यद्यपि, अन्य जमाने वाले एजेंट, जैसे सिलिका जेल, का भी उपयोग किया जा सकता है।

(iii) अर्ध-ठोस अगर माध्यम

अर्ध-ठोस माध्यम तैयार किए जाते हैं माध्यम में $0.5 %$ अगर मिलाकर। इस प्रकार का माध्यम चयनात्मक हो सकता है क्योंकि यह एक जीव की वृद्धि को बढ़ावा देता है और दूसरे जीव की वृद्धि को रोक सकता है।

(C) उनके अनुप्रयोग और कार्यों के आधार पर, संवर्धन माध्यमों को निम्नलिखित प्रकारों में वर्गीकृत किया गया है

(i) चयनात्मक माध्यम

चयनात्मक माध्यम किसी विशेष प्रकार के सूक्ष्मजीव की वृद्धि को बढ़ावा देता है। ये पोषक तत्व प्रदान करते हैं जो किसी विशेष प्रकार के सूक्ष्मजीव की वृद्धि को बढ़ाते हैं और संस्कृति में मौजूद अन्य सभी सूक्ष्मजीवों को दबाते हैं। यह माध्यम मिश्रित जनसंख्या से किसी विशिष्ट सूक्ष्मजीव को पृथक करने के लिए उपयोगी होता है। इस प्रकार, सेलूलोज़ पचाने वाले जीवाणुओं के पृथक्करण के लिए, केवल सेलूलोज़ को कार्बन और ऊर्जा स्रोत के रूप में रखने वाला माध्यम प्रयोग किया जाता है। एंडो ऐगर, ईओसिन मेथिलीन ब्लू ऐगर और मैककोनकी ऐगर माध्यम ई. कोलाई और समान जीवाणुओं की वृद्धि के लिए प्रयोग किए जाते हैं। कुछ माध्यम जो बाइल लवण या रंजक जैसे बेसिक फ्यूचिन और क्रिस्टल वॉयलेट रखते हैं, ग्राम-धनात्मक जीवाणुओं की वृद्धि को दबाने के लिए लेकिन ग्राम-ऋणात्मक जीवाणुओं की वृद्धि को प्रोत्साहित करने के लिए प्रयोग किए जाते हैं।

(ii) विभेदक माध्यम

विभेदी माध्यमों का उपयोग विभिन्न समूहों के सूक्ष्मजीवों को माध्यम पर उनकी उपस्थिति के साथ-साथ उनकी जैविक विशेषताओं के आधार पर भेद करने के लिए किया जाता है, जो सूक्ष्मजीव की पहचान की अनुमति देते हैं। उदाहरण के लिए, यदि बैक्टीरिया के मिश्रण को रक्त-युक्त अगर माध्यम (ब्लड अगर) पर अनुप्रेषित किया जाता है, तो कुछ बैक्टीरिया लाल रक्त कोशिकाओं को हेमोलाइज़ (नष्ट) कर सकते हैं और अन्य नहीं। इस प्रकार, यह माध्यम हेमोलिटिक और गैर-हेमोलिटिक बैक्टीरिया के बीच भेद करता है। इसलिए, ब्लड अगर माध्यम एक विभेदी माध्यम के साथ-साथ एक समृद्ध माध्यम भी है। मैककोन्की अगर को भी विभेदी और चयनात्मक दोनों माध्यमों के अंतर्गत रखा जाता है। इस माध्यम में कुछ संकेतक होते हैं जो ऐसे विभेदन की अनुमति देते हैं। उदाहरण के लिए, मैककोन्की अगर में लैक्टोज़ और एक रंजक होता है (जो $\mathrm{pH}$ गिरने पर रंग बदलता है)। वे सूक्ष्मजीव जो लैक्टोज़ को किण्वित करते हैं, अंतिम उत्पाद के रूप में एक अम्ल उत्पन्न करते हैं, जो $\mathrm{pH}$ को कम करता है और एक लाल कालोनी उत्पन्न करता है। सूक्ष्मजीव जो लैक्टोज़ को किण्वित करने में विफल रहते हैं, वे रंगहीन कालोनियाँ उत्पन्न करते हैं। मैककोन्की अगर में उपस्थित रंजक ग्राम-धनात्मक बैक्टीरिया की वृद्धि को भी रोकता है। यह माध्यम, इसलिए, चयनात्मक और विभेदी दोनों है।

(iii) समृद्धि माध्यम

संवर्धन माध्यम में, पोषण वातावरण को इस प्रकार समायोजित किया जाता है ताकि मिश्रित इनोकुलम के भीतर कुछ विशिष्ट सूक्ष्मजीवों की वृद्धि को चयनात्मक रूप से बढ़ाया जा सके। उदाहरण के लिए, न्यूट्रिएंट ब्रॉथ और न्यूट्रिएंट ऐगर माध्यम में पौधों और जानवरों के ऊतक अर्क को मिलाने से अतिरिक्त पोषक तत्व प्रदान होते हैं जो दुरूह हेटरोट्रोफिक जीवाणुओं की वृद्धि को बढ़ावा देते हैं। ब्लड ऐगर भी एक संवर्धन माध्यम है।

6.3 निर्जीवीकरण विधियाँ

किसी भी सूक्ष्मजीव अध्ययन में, सभी माध्यम, कार्य सतह, काँच के बर्तन और प्लास्टिक के बर्तन दूषित पदार्थों से मुक्त होने चाहिए। इस प्रकार, कार्य प्रारंभ करने से पहले निर्जीवीकरण तकनीकों के बारे में विस्तृत समझ होना आवश्यक है।

• निर्जीवीकरण वह प्रक्रिया है जिसमें सभी जीवित सूक्ष्मजीवों, जिनमें जीवाणु बीजाणु भी शामिल हैं, को मारा या हटाया जाता है।
• कीटाणुनाशन को उस प्रक्रिया के रूप में परिभाषित किया गया है जिसमें अजीव वस्तुओं से अधिकांश रोगजनक सूक्ष्मजीवों (जीवाणु बीजाणुओं को छोड़कर) का उन्मूलन किया जाता है। कीटाणुनाशन भौतिक या रासायनिक विधियों द्वारा प्राप्त किया जा सकता है।
• विषैलेपन का उन्मूलन उपकरणों और सतहों से दूषित रोगजनक सूक्ष्मजीवों को निर्जीवीकरण या कीटाणुनाशन प्रक्रिया द्वारा समाप्त करने की प्रक्रिया है।
• स्वच्छता रासायनिक या यांत्रिक सफाई की प्रक्रिया है, अर्थात् स्वच्छता द्वारा सूक्ष्मजीव जनसंख्या को उस स्तर तक कम किया जाता है जो सार्वजनिक स्वास्थ्य प्रणालियों में सुरक्षित और लागू माना जाता है।
• प्रतिजैविक एक सूक्ष्मजीव द्वारा उत्पादित पदार्थ होते हैं जो अन्य सूक्ष्मजीवों को रोकता है या मारता है।

आमतौर पर, निष्शेषण भौतिक और रासायनिक दोनों विधियों से प्राप्त किया जा सकता है। भौतिक विधियों में, निष्शेषण ऊष्मा, विकिरण और निस्यंदन द्वारा किया जा सकता है, जबकि रासायनिक विधियों में, निष्शेषण रसायनों का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है।

ऊष्मा द्वारा निष्शेषण

ऊष्मा द्वारा निष्शेषण को सबसे प्रभावी और तीव्र विधि माना जाता है उन वस्तुओं के लिए जो ऊष्मा सहन कर सकती हैं। ऊष्मा प्रोटीनों के विकृतीकरण, जमावट, ऑक्सीडेटिव प्रभाव डालने और कोशिकाओं की मृत्यु का कारण बनने वाली चयापचयी अभिक्रियाओं में हस्तक्षेप करके कार्य करती है। ऊष्मा द्वारा निष्शेषण विभिन्न विधियों से किया जाता है:

(a) उबालना: निष्शेषण $100^{\circ} \mathrm{C}$ पर उबलते पानी के स्नान में $30 \mathrm{~min}$ तक किया जा सकता है। सिरिंज, रबर के सामान और शल्य चिकित्सा उपकरणों को इस विधि से निष्शेषित किया जा सकता है।

(ब) ऑटोक्लेविंग: ऑटोक्लेविंग लगभग सभी प्रयोगशालाओं में निर्जीवीकरण की सबसे सामान्य विधियों में से एक है। इस विधि में, दबाव के तहत $100^{\circ} \mathrm{C}$ से अधिक तापमान पर भाप द्वारा निर्जीवीकरण किया जाता है। वायुमंडलीय दबाव पर, पानी $100^{\circ} \mathrm{C}$ पर उबलता है, लेकिन यदि दबाव बढ़ाया जाए, तो उबलने का तापमान भी बढ़ जाता है। एक ऑटोक्लेव में, पानी को एक बंद वायुरोधी कक्ष में उबाला जाता है। ऑटोक्लेव के अंदर प्रति वर्ग इंच $15 \mathrm{lb}$ (psi) के दबाव पर, तापमान को $121^{\circ} \mathrm{C}$ तक बढ़ाया जाता है। एक ऑटोक्लेव में, वस्तुओं को इस तापमान पर निकलने वाली भाप के संपर्क में रखा जाता है और निर्जीवीकरण प्राप्त किया जाता है। ऑटोक्लेव ऊध्र्वाधर या क्षैतिज डिज़ाइन के होते हैं और वे जैकेटेड तथा नॉन-जैकेटेड हो सकते हैं (चित्र 6.2)। जैकेटेड ऑटोक्लेव में, भाप जैकेट के चारों ओर प्रवाहित होती है जिसमें वस्तुएं/माध्यम रखे जाते हैं और वे सीधे भाप के संपर्क में नहीं आते हैं, जबकि नॉन-जैकेटेड ऑटोक्लेव में, वस्तुएं/माध्यम सीधे भाप के संपर्क में आते हैं। ऑटोक्लेविंग में होल्डिंग समय वह समय होता है जिसके लिए ऑटोक्लेव में रखा गया संपूर्ण भार एक्सपोज़ किया जाता है और वास्तविक निर्जीवीकरण होता है। होल्डिंग समय भार के आकार और प्रकार पर निर्भर करता है और आमतौर पर 30 $\min$ से अधिक होता है।

चित्र 6.2: (a) ऊध्र्वाधर ऑटोक्लेव (b) क्षैतिज ऑटोक्लेव (फोटो सौजन्य: डॉ. वेदा पी. पांडेय)

(c) पाश्चुरीकरण: यह प्रक्रिया खाद्य और डेरी उद्योग में प्रयोग की जाती है। वास्तव में, पाश्चुरीकरण दूध को एक निश्चित तापमान पर निश्चित समय तक गरम करना है ताकि दूध में मौजूद रोगजनक सूक्ष्मजीव नष्ट हो जाएँ। यह दूध को पूरी तरह बाँझ नहीं बनाता, इसलिए कई जीवित सूक्ष्मजीव जिनमें बीजाणु भी शामिल हैं, नष्ट नहीं होते। पाश्चुरीकरण की दो विधियाँ हैं, होल्डर विधि (निम्न तापमान दीर्घ काल, LTLT, $63^{\circ} \mathrm{C}$ पर $30 \mathrm{~min}$ तक गरम किया जाता है) और फ्लैश विधि (उच्च तापमान अल्प काल, HTST, $72^{\circ} \mathrm{C}$ पर $15 \mathrm{sec}$ तक गरम किया जाता है) जिसके बाद तेजी से ठंडा किया जाता है। अन्य पाश्चुरीकरण विधियाँ भी उपलब्ध हैं, जैसे अल्ट्रा-हाई टेम्परेचर (UHT) $140-150^{\circ} \mathrm{C}$ पर $1-3$ सेकंड के लिए।

(d) गरम करना और जलाना: कई वस्तुओं को पानी की अनुपस्थिति में शुष्क ताप से बाँझ किया जाता है। ऐसी वस्तुएँ, जैसे इनोक्यूलेशन लूप, सीधे तार, फोरसेप्स की नोक और स्पैटुला को बंसन फ्लेम में तब तक रखकर बाँझ किया जाता है जब तक वे लाल-गरम न हो जाएँ। जबकि कुछ वस्तुएँ, जैसे टेस्ट ट्यूबों, फ्लास्कों, कांच की स्लाइडों आदि के मुँह को बिना लाल-गरम होने दिए कुछ बार फ्लेम से गुजारा जाता है। हॉट एयर ओवन का उपयोग भी कांच के बर्तनों को बाँझ करने के लिए किया जाता है।

विकिरण द्वारा बाँझकरण

स्टेरिलाइज़ेशन के लिए दो प्रकार की विकिरण, अर्थात् आयनकारी और अनायनकारी विकिरणों का उपयोग किया जाता है। चूँकि विकिरण ऊष्मा उत्पन्न नहीं करता, इसलिए विकिरण द्वारा स्टेरिलाइज़ेशन को ‘कोल्ड स्टेरिलाइज़ेशन’ कहा जाता है। अनायनकारी विकिरण, जैसे कि पराबैंगनी किरणें, 200-280 नैनोमीटर तरंगदैर्ध्य सीमा में जीवाणुनाशक गतिविधि रखती हैं, जिसमें 260 नैनोमीटर सबसे प्रभावी होता है। पराबैंगनी किरणें थाइमिन-थाइमिन डाइमर बनाती हैं, जो अंततः डीएनए प्रतिकृति को रोकते हैं और कोशिकाओं में उत्परिवर्तन उत्पन्न करते हैं। पराबैंगनी विकिरण सतह कीटाणुनाशन के लिए उपयोगी है, अर्थात् संस्कृति प्रयोगशाला, लैमिनर हुड, ऑपरेशन थिएटर, वायरस प्रयोगशालाओं आदि को कीटाणुरहित करने के लिए। पराबैंगनी किरणों के नुकसानों में त्वचा और आँखों पर हानिकारक प्रभाव तथा डीएनर मरम्मत जीवाण्वीय एंजाइमों के कारण क्षति की उलटी क्रिया शामिल है। आयनकारी विकिरण दो प्रकार के होते हैं, कणिकीय (इलेक्ट्रॉन बीम) और विद्युतचुंबकीय किरणें (गामा किरणें)। इलेक्ट्रॉन बीम का उपयोग सिरिंज, दस्ताने, ड्रेसिंग पैक, खाद्य और फार्मास्यूटिकल्स आदि को स्टेरिलाइज़ करने के लिए किया जाता है। विद्युतचुंबकीय किरणों में इलेक्ट्रॉन बीम की तुलना में अधिक भेदन क्षमता होती है, परंतु इनके लिए अधिक एक्सपोज़र समय की आवश्यकता होती है। ये विकिरण सूक्ष्मजीवों की न्यूक्लिक अम्ल को क्षति पहुँचाते हैं। विद्युतचुंबकीय विकिरणों का उपयोग डिस्पोज़ेबल पेट्री डिश, प्लास्टिक सिरिंज, एंटीबायोटिक्स, विटामिन, हार्मोन, ग्लासवेयर और फैब्रिक्स को स्टेरिलाइज़ करने के लिए किया जाता है।

फिल्ट्रेशन द्वारा स्टेरिलाइज़ेशन

छानने (फिल्ट्रेशन) का उपयोग उन विलयनों में उपस्थित ऊष्मा-संवेदी पदार्थों—जैसे सीरम, एंटीबायोटिक्स, शर्करा, यूरिया आदि—को निर्जीवित करने के लिए किया जाता है। छानने से सूक्ष्मजीव मरते नहीं, बल्कि आकार के आधार पर अलग हो जाते हैं। $0.2-0.45 \mu \mathrm{m}$ छिद्र-व्यास वाली झिल्ली फिल्टर आमतौर पर विलयनों से सूक्ष्मजीव हटाने के लिए प्रयुक्त होती हैं। वायु को उच्च दक्षता वाले कणीय वायु (HEPA) फिल्टर द्वारा छाना जा सकता है। HEPA फिल्टर $>0.3 \mu \mathrm{m}$ व्यास के कणों को हटाने में 99.97 प्रतिशत तक दक्ष होते हैं। इनका प्रयोग सामान्यतः जैविक सुरक्षा कैबिनेटों में होता है।

रसायनों द्वारा निर्जीवन

निर्जीवन/विसंक्रमण कुछ रसायनों—जैसे एल्कोहॉल, ऐल्डिहाइड, भारी धातुएँ आदि—द्वारा भी प्राप्त किया जा सकता है। एल्कोहॉल कोशिका निर्जलीकरण, झिल्ली विघटन और प्रोटीन के थक्के बनाकर सतह को निर्जीवित करते हैं। 70 प्रतिशत एथिल एल्कोहॉल त्वचा पर प्रतिजीवक (एंटीसेप्टिक) के रूप में प्रयुक्त होता है। आइसोप्रोपिल एल्कोहॉल सतहों और नैदानिक थर्मामीटर को विसंक्रमित करने के लिए प्रयोग किया जा सकता है। ऐल्डिहाइड, जैसे 40 प्रतिशत फॉर्मेल्डिहाइड (फॉर्मेलिन), सतह विसंक्रमण और कमरों, चैम्बरों, ऑपरेशन थिएटरों, जैविक सुरक्षा कैबिनेटों आदि के धूम्रीकरण के लिए प्रयोग होता है। भारी धातुएँ—जैसे पारा, चाँदी, आर्सेनिक, जिंक और ताँबा—जीवाणुनाशक के रूप में प्रयुक्त होती हैं; ये प्रोटीन के अवक्षेपण का कारण बनती हैं। हाइड्रोजन पेरॉक्साइड विलयन घावों और अल्सर की त्वचा के विसंक्रमण तथा घाव ड्रेसिंग की दुर्गंध दूर करने के लिए प्रयोग होता है।

6.4 विशुद्ध संवर्धन तकनीक

बैक्टीरिया को या तो तरल या ठोस माध्यम का उपयोग करके संवर्धित किया जा सकता है। ठोस माध्यम विशेष रूप से बैक्टीरिया के पृथक्करण में उपयोगी होते हैं और इनका उपयोग उनके दीर्घकालिक भंडारण के लिए भी किया जाता है, जबकि तरल (ब्रॉथ) संस्कृतियों का उपयोग बैक्टीरिया के तेजी से और बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए किया जाता है।

जैसा कि आप जानते हैं, प्राकृतिक आवास में सूक्ष्मजीव अनगिनत अन्य सूक्ष्मजीवों के साथ मिलकर जटिल पारिस्थितिक तंत्रों का हिस्सा होते हैं। किसी विशिष्ट सूक्ष्मजीव का अध्ययन करने के लिए शुद्ध संवर्धन प्राप्त करना महत्वपूर्ण होता है। एक ऐसा संवर्धन जिसमें पूरी तरह से एक ही प्रकार के जीव होते हैं, उसे शुद्ध संवर्धन कहा जाता है।

शुद्ध बैक्टीरियल संवर्धन प्राप्त करने की मानक विधि स्ट्रीक प्लेट विधि है (चित्र 6.3)। एक इनोक्यूलेटिंग लूप का उपयोग करके बैक्टीरियल सस्पेंशन या बैक्टीरियल कॉलोनी की एक बूंद को एक ठोस आगर प्लेट पर इस प्रकार फैलाया जाता है कि वह क्रमशः अधिक तनु होती जाती है। उपयुक्त तापमान पर उचित ऊष्मायन के बाद, कोशिका विभाजन के कारण दृश्य बैक्टीरियल कॉलोनियाँ विकसित होती हैं। कॉलोनियाँ इसलिए बनती हैं क्योंकि सभी संतति एक ही स्थान पर रहती हैं और ठोस सतह पर पुत्री कोशिकाओं की गति संभव नहीं होती है। दूसरे शब्दों में, एक साथ जमा हुई कोशिकाओं का एक समूह एक कॉलोनी उत्पन्न करता है। स्ट्रीक के अंत के पास, पृथक कॉलोनियाँ प्राप्त होती हैं।

चित्र 6.3: स्ट्रीक प्लेट विधि

शुद्ध संस्कृतियों के पृथक्करण की एक वैकल्पिक विधि डाल-प्लेट विधि है (चित्र 6.4)। इस विधि में, मूल सूक्ष्मजीव नमूने को कई बार तनु किया जाता है ताकि जनसंख्या को पर्याप्त रूप से तनु किया जा सके और प्लेटिंग पर अलग-अलग कॉलोनियाँ प्राप्त हो सकें। प्रत्येक तनुकरण की छोटी मात्राएँ $(1 \mathrm{~mL})$ पेट्री प्लेट/डिश के तल पर डाली जाती हैं। इसके बाद, पिघला हुआ माध्यम जिसमें ऐगर होता है, पेट्री प्लेटों पर डाला जाता है और धीरे-धीरे गोलाकार गति से मिलाया जाता है। उपयुक्त तापमान पर ऊष्मायन के बाद, पृथक कोशिकाएँ कॉलोनियों में विकसित होती हैं जिनका उपयोग शुद्ध संस्कृतियाँ स्थापित करने के लिए किया जा सकता है।

चित्र 6.4: डाल-प्लेट विधि

फैलाव-प्लेट तकनीक शुद्ध संस्कृति प्राप्त करने की एक और आसान और प्रत्यक्ष विधि है (चित्र 6.5)। इस तकनीक में, तनु किए गए जीवाणु मिश्रण की एक छोटी मात्रा को एक ठोस ऐगर प्लेट के केंद्र में स्थानांतरित किया जाता है और एक निर्जीव, L-आकार का काँच का फैलावक (spreader) उपयोग करके समान रूप से सतह पर फैलाया जाता है। काँच की छड़ को आमतौर पर शराब में डुबोकर निर्जीव किया जाता है और फिर शराब को जलाने के लिए जलाया जाता है। उपयुक्त तापमान पर उचित ऊष्मायन के बाद, कुछ बिखरी हुई कोशिकाएँ पृथक कॉलोनियों में विकसित होती हैं।

चित्र 6.5: स्प्रेड-प्लेट तकनीक

6.5 सूक्ष्मजीव वृद्धि को प्रभावित करने वाले कारक

सूक्ष्मजीव वृद्धि कई कारकों से प्रभावित हो सकती है। प्रमुख कारक नीचे वर्णित हैं:

तापमान

सूक्ष्मजीव तापमान की विस्तृत श्रेणी में वृद्धि करने में सक्षम होते हैं। किसी सूक्ष्मजीव के लिए न्यूनतम और अधिकतम वृद्धि तापमान सामान्यतः लगभग $25-45^{\circ} \mathrm{C}$ होता है। वृद्धि दर तापमान के साथ बढ़ती है जब तक कि इष्टतम तापमान प्राप्त नहीं हो जाता, और उसके बाद एंजाइमी क्रियाकलाप में कमी के कारण वृद्धि दर फिर घटने लगती है। अधिकांश सूक्ष्मजीव लगभग $20-45^{\circ} \mathrm{C}$ की सीमा में इष्टतम वृद्धि प्राप्त करते हैं और इन्हें मीसोफाइल कहा जाता है। कुछ सूक्ष्मजीव लगभग $40-80^{\circ} \mathrm{C}$ की सीमा के भीतर वृद्धि करने में सक्षम होते हैं, जिनका इष्टतम तापमान लगभग $50-65^{\circ} \mathrmC$ होता है और इन्हें थर्मोफाइल कहा जाता है। इसके अतिरिक्त, कुछ चरम थर्मोफाइल होते हैं जो $100^{\circ} \mathrmC}$ से अधिक तापमान को सहन कर सकते हैं।

pH

सूक्ष्मजीवों की वृद्धि उनके आस-पास के pH के परिवर्तन से प्रबल रूप से प्रभावित होती है। बैक्टीरिया की तुलना में फ़फूंदें pH के विस्तृत परिसर को सहन कर सकती हैं। अधिकांश सूक्ष्मजीव उत्तम रूप से उदासीनता (pH 7) के आस-पास विकसित होते हैं। कई बैक्टीरिया थोड़ी क्षारीय स्थितियों को पसंद करते हैं, परन्तु कुछ ही अम्लीय स्थितियों को सहन करते हैं। दूसरी ओर, फ़फूंदें सामान्यतः थोड़ी अम्लीय स्थितियों को पसंद करती हैं और इसलिए जब ये एक साथ रहती हैं तो बैक्टीरिया पर प्रभुत्व करती हैं। विकास माध्यम का pH अभीष्ट मान पर उस प्रकार के सूक्ष्मजीवों के अनुसार समायोजित किया जाता है, जिसके लिए तैयारी के दौरान अम्ल या क्षारक मिलाया जाता है।

ऑक्सीजन

ऑक्सीजन हमारे वातावरण के प्रमुख घटकों में से एक (21%) के रूप में उपस्थित है, और सूक्ष्मजीव जो जीवित रहने के लिए ऑक्सीजन पर निर्भर होते हैं, उन्हें ऐरोब कहा जाता है। कुछ सूक्ष्मजीव ऑक्सीजन की अनुपस्थिति में भी जीवित रहने में सक्षम होते हैं और उन्हें ऐनेरोब कहा जाता है। ऐरोबिक जीवों की संस्कृति के दौरान ऑक्सीजन प्रदान की जानी चाहिए। पेट्री डिश में मौजूद माध्यम की एक पतली परत के लिए, पर्याप्त ऑक्सीजन सतह की नमी में घुली हुई उपलब्ध होती है। लेकिन ब्रॉथ के एक फ्लास्क में, ऐरोब केवल सतह की परतों पर ही बढ़ेंगे, इसलिए अतिरिक्त ऑक्सीजन हिलाने या यांत्रिक हलचल द्वारा प्रदान की जाती है ताकि समान वृद्धि सुनिश्चित हो सके। अनिवार्य ऐनेरोब ऑक्सीजन को सहन नहीं कर सकते और उन्हें विशेष ऐनेरोबिक चैंबरों में संस्कृत किया जाता है, जहाँ सभी तरल और ठोस माध्यमों से ऑक्सीजन को बाहर रखा जाता है। वैकल्पिक ऐनेरोब ऑक्सीजन की उपस्थिति में ऐरोब की तरह जीवित रह सकते हैं, और ऐनेरोबिक स्थिति में भी जीवित रहने में सक्षम होते हैं। एरोटॉलरेंट ऐनेरोब वे जीव होते हैं जो आमतौर पर ऐनेरोबिक होते हैं, लेकिन वातावरणीय ऑक्सीजन द्वारा रोके नहीं जाते क्योंकि वे इसका उपयोग नहीं करते।

कार्बन डाइऑक्साइड

स्वपोषी जीव कार्बन डाइऑक्साइड को कार्बन स्रोत के रूप में उपयोग करने में सक्षम होते हैं और जब उन्हें संस्कृति में उगाया जाता है, तो $CO_2$ को उनके वृद्धि माध्यम में बाइकार्बोनेट के रूप में प्रदान किया जाता है या उन्हें $\mathrm{CO}_{2}$ से समृद्ध वातावरण में इनक्यूबेट किया जाता है।

प्रकाश

प्रकाशजीवी सूक्ष्मजीवों को प्रकाश संश्लेषण करने के लिए प्रकाश की आवश्यकता होती है। प्रयोगशाला में सूक्ष्मजीवों की संवर्धन के दौरान यह सुनिश्चित किया जाना चाहिए कि सही तरंगदैर्ध्य का प्रकाश प्रयोग किया जाए।

6.6 वृद्धि वक्र

जब एकल कोशिकीय सूक्ष्मजीवों को उपयुक्त पोषक माध्यम में प्रारंभिक सीमित मात्रा में पोषक तत्वों के साथ उगाया जाता है, तो कोशिकाएँ अपनी संख्या और आकार में अधिकतम दर से वृद्धि करना प्रारंभ करती हैं। कृत्रिम माध्यम में कोशिकाओं की वृद्धि विभिन्न कारकों पर निर्भर करती है जिनमें पोषक कारक, पर्यावरणीय कारक आदि शामिल हैं। पोषक माध्यम में कोशिकाओं की वृद्धि कोशिका सांद्रण पर निर्भर करती है और इस प्रक्रिया का परिणाम कोशिकीय प्रजनन होता है। एकल कोशिकीय जीव द्विभाजन द्वारा विभाजित होते हैं, अपनी आनुवांशिक सामग्री की प्रतिकृति बनाते हैं, फिर दो समान कोशिकाओं में विभाजित होते हैं जो फिर चार में, चार आठ में और इसी तरह विभाजित होते हैं, जिससे कोशिकाओं की संख्या में घातीय वृद्धि होती है। संवर्धित सूक्ष्मजीवों की इस वृद्धि का विश्लेषण जीवित कोशिकाओं की संख्या के लघुगणक को इनक्यूबेशन समय के विरुद्ध आलेखित करके किया जा सकता है, जिससे एक ऐसा वक्र प्राप्त होता है जिसमें चार विशिष्ट चरण होते हैं: विलंब चरण, घातीय चरण, स्थिर चरण और पतन चरण (चित्र 6.6)।

चित्र 6.6: सूक्ष्मजीव वृद्धि वक्र

विलंब चरण

प्रारंभ में, जब सूक्ष्मजीवों को ताजा कल्चर माध्यम में डाला जाता है, तो आमतौर पर तुरंत कोशिका संख्या में वृद्धि देखी नहीं जाती, और इसलिए इस अवधि को लैग चरण कहा जाता है। कोशिका विभाजन की कमी के कारण, लैग चरण के दौरान द्रव्य में कोई शुद्ध वृद्धि नहीं होती, कोशिका विभाजन के लिए आवश्यक नए घटकों का संश्लेषण कर रही होती है। लैग चरण की अवधि अंतर्गत सूक्ष्मजीवों की स्थिति और माध्यम की प्रकृति के अनुसार भिन्न होती है। यह चरण लंबा हो सकता है यदि इनोकुलम पुरानी कल्चर या रेफ्रिजरेटेड कल्चर से लिया गया हो। दूसरी ओर, जब कोई युवा या बढ़ती हुई सूक्ष्मजीव कल्चर को ताजे माध्यम में इनोकुलेट किया जाता है, तो लैग चरण छोटा हो सकता है या यहां तक कि अनुपस्थित भी हो सकता है।

घातीय चरण

घातीय या लॉग चरण के दौरान, सूक्ष्मजीव अधिकतम दर से बढ़ रहे होते हैं और विभाजित हो रहे होते हैं। घातीय चरण के दौरान सूक्ष्मजीव नियमित अंतरालों पर संख्या में दोगुने हो रहे होते हैं और वृद्धि दर स्थिर होती है। इस चरण में, जनसंख्या एक विशिष्ट समय अवधि के दौरान संख्या में दोगुनी हो जाएगी जिसे जनन समय या दोगुना समय कहा जाता है। उदाहरण के लिए, $E$. coli के लिए दोगुना समय 20 मिनट है। घातीय वृद्धि के दौरान, दोगुना समय को इस प्रकार व्यक्त किया जा सकता है:

$$ \begin{aligned} & \qquad t_{d}=\frac{0.693}{\mu} \\ & \mu=\text { विशिष्ट वृद्धि दर }\left[\mu=2.303 \frac{\left(\log X_{t}-\log X_{0}\right)}{t}\right] \\ & X_{t}=\text { समय } t \text { पर कोशिका सांद्रता } \\ & X_{o}=\text { प्रारंभिक कोशिका सांद्रता } \\ & t=\text { लिया गया समय } \\ & t_{d}=\text { द्विगुणन समय } \end{aligned} $$

इस चरण के दौरान जनसंख्या रासायनिक और शारीरिक गुणों के मामले में सबसे अधिक समरूप होती है, और इसलिए इस चरण के सूक्ष्मजीव आमतौर पर जैव रासायनिक और शारीरिक अध्ययनों के लिए प्रयुक्त होते हैं।

स्थिर चरण

लॉग चरण की एक निश्चित अवधि के बाद जनसंख्या वृद्धि रुक जाती है और वृद्धि वक्र क्षैतिज हो जाता है। यह समग्र पोषक तत्वों की उपलब्धता और अन्य कारकों के साथ-साथ संवर्धित किए जा रहे सूक्ष्मजीव के प्रकार पर निर्भर करता है। स्थिर चरण के दौरान कोशिका विभाजन और कोशिका मृत्यु के बीच संतुलन विकसित होने के कारण जीवित सूक्ष्मजीवों की कुल संख्या स्थिर रहती है। सूक्ष्मजीव जनसंख्या के स्थिर चरण में प्रवेश करने के कई कारक होते हैं। एक महत्वपूर्ण कारक पोषक तत्वों की सीमा है; यदि कोई आवश्यक पोषक तत्व गंभीर रूप से समाप्त हो जाता है, तो जनसंख्या वृद्धि धीमी हो जाएगी।

मृत्यु चरण

अनुकूल नहीं पर्यावरणीय परिस्थितियाँ, जैसे पोषक तत्वों की कमी, विषाक्त अपशिष्टों का संचय आदि, जीवित कोशिकाओं की संख्या में और गिरावट का कारण बनते हैं जो

बॉक्स 2

सूक्ष्मजीव वृद्धि का मापन

संतुलित वृद्धि से गुजरने वाली सूक्ष्मजीव कोशिका संवर्धन एक रासायनिक अभिक्रिया के समान होती है जहाँ माध्यम में उपस्थित क्रियाधारक कोशिका द्रव्य में रूपांतरित होते हैं।

सूक्ष्मजीव वृद्धि की विशेषता बताने वाला मापदंड द्विगुणन समय है जिसे उत्पत्ति समय $\boldsymbol{t}_{\boldsymbol{d}}$ भी कहा जाता है। यह वह समय ($t$) है जो मिनटों/घंटों में लगता है ताकि संतुलित वृद्धि के दौरान कोशिका द्रव्य या कोशिका संख्या अपने मूल मान से दोगुनी हो जाए।

$$ t_{d}=t / n \quad(n=\text { पीढ़ियों की संख्या }) $$

विशिष्ट वृद्धि दर $\mu$, किसी विशेष वातावरण में सूक्ष्मजीवों की वृद्धि का सूचकांक है। इसे कोशिका जनसंख्या के जैवद्रव्य में वृद्धि की दर को प्रति इकाई जैवद्रव्य सांद्रता के रूप में परिभाषित किया गया है। $\mu$ का मान प्रत्येक सूक्ष्मजीव के लिए विशिष्ट होता है। यह तापमान, $\mathrm{pH}$, माध्यम संरचना और माध्यम में घुला $\mathrm{O}_{2}$ पर निर्भर करता है।

जैसे-जैसे $\mu$ का मान बढ़ता है, अर्थात् विशिष्ट वृद्धि दर वाली सूक्ष्मजीव संवर्धन में द्विगुणन समय कम होता है।

किसी सूक्ष्मजीव के $\mu$ और $t_{d}$ के मान के आधार पर, माध्यम संरचना और किण्वन बैच समय का निर्णय लिया जाता है ताकि वाणिज्यिक किण्वकों में उत्पादन को अनुकूलित किया जा सके।

उदाहरण

यदि कोई संवर्धन $t_{0}$ पर $10^{4}$ कोशिकाएँ$/\mathrm{mL}$ और $2 \mathrm{~h}$ बाद $10^{8}$ कोशिकाएँ$/\mathrm{ml}$ रखता है, तो संवर्धन की विशिष्ट वृद्धि दर और उत्पत्ति समय की गणना कीजिए।

हल:

$X_0=10^4 \text { कोशिकाएँ } / mL $

$X_t=10^8 \text { कोशिकाएँ } / mL$

$t=2{~h}$

(i) $\mu=2.303 \frac{\left(\log 10^{8}-\log 10^{4}\right)}{2}$

$ \begin{aligned} & =2.303 \frac{(8-4)}{2} \\ & =2.303 \frac{(4)}{2}=4.606 \mathrm{hr}^{-1} \end{aligned} $

(ii) $\mathrm{t}_{d}=\frac{0.693}{\mu}=\frac{0.693}{4.606}=0.15 \mathrm{~h}$

यह पतन/मृत्यु प्रावस्था की विशेषता है। इस प्रावस्था के दौरान सूक्ष्मजीवी जनसंख्या की मृत्यु सामान्यतः लघुगणकीय होती है (जैसे कि चरम प्रावस्था के दौरान वृद्धि होती है)। उपचयी अपशिष्ट उत्पादों का संचय प्रायः जनसंख्या वृद्धि के पतन का कारक बन जाता है। उदाहरण के लिए, स्ट्रेप्टोकोकी नामक जीवाणु चीनी के किण्वन से लैक्टिक अम्ल व अन्य कार्बनिक अम्ल उत्पन्न कर सकते हैं जिससे माध्यम अम्लीय हो जाता है और वृद्धि अवरुद्ध हो जाती है।

सारांश

• सूक्ष्मजीव विज्ञान छोटे जीव रूपों, अर्थात् सूक्ष्मजीवों, के बारे में अध्ययन है।
• सूक्ष्मजीवों को वृद्धि और गुणन के लिए ऊर्जा, कार्बन, नाइट्रोजन, ऑक्सीजन, लोहा और अन्य खनिजों, सूक्ष्म पोषक तत्वों और जल के स्रोत की आवश्यकता होती है।
• सूक्ष्मजीवों के लिए उपयुक्त कल्चर माध्यम का चयन सूक्ष्मजीवों के आवास के पूर्व ज्ञान पर निर्भर करता है।
• कल्चर माध्यमों को रासायनिक संरचना के आधार पर वर्गीकृत किया जा सकता है। माध्यम दो प्रकारों में वर्गीकृत होते हैं: संश्लेषित और जटिल माध्यम। जबकि स्थिरता के आधार पर, कल्चर माध्यम ठोस, द्रव और अर्धठोस हो सकते हैं। जबकि उनके अनुप्रयोग और कार्यों के आधार पर, माध्यमों को चयनात्मक, विभेदक और समृद्धि माध्यमों में विभाजित किया जा सकता है।
• किसी भी सूक्ष्मजीव अध्ययन के लिए निर्जीवीकरण सर्वोपरि महत्व रखता है और यह वह प्रक्रिया है जिसमें सभी जीवित सूक्ष्मजीव, जिनमें जीवाणु बीजाणु भी शामिल हैं, को मारा या हटाया जाता है।
• निर्जीवीकरण भौतिक (ऊष्मा, विकिरण और निस्यंदन) और रासायनिक विधियों द्वारा प्राप्त किया जा सकता है।
• सूक्ष्मजीव वृद्धि कई भौतिक कारकों, जैसे तापमान, $\mathrm{pH}$, ऑक्सीजन आदि द्वारा प्रभावित हो सकती है।
• कल्चर किए गए सूक्ष्मजीवों की वृद्धि को जीवित कोशिकाओं की संख्या का लघुगणक बनाम इनक्यूबेशन समय के प्लॉट द्वारा विश्लेषित किया जा सकता है, जिससे चार स्पष्ट चरणों—लैग, घातीय, स्थिर और मृत्यु चरण—वाला एक वक्र प्राप्त होता है।

अभ्यास

1. सूक्ष्मजीवों की पोषण संबंधी आवश्यकताओं का वर्णन कीजिए।

२. कल्चर मीडिया क्या है? कल्चर मीडिया का वर्गीकरण कीजिए।

३. किसी सूक्ष्मजीव की वृद्धि वक्र विश्लेषण का वर्णन कीजिए।

४. शुद्ध कल्चर को पृथक करने की कोई दो विधियों की चर्चा कीजिए।

५. निर्जीवीकरण, कीटाणुनाशन और सैनिटाइज़ेशन की परिभाषा दीजिए।

६. निर्जीवीकरण की विभिन्न विधियों का विस्तृत वर्णन कीजिए।

७. जीवाणु उपभेद जिन्हें किसी कार्बनिक पूरक की आवश्यकता नहीं होती, उन्हें कहा जाता है:

(a) ऑक्सोट्रोफ
(b) प्रोटोट्रोफ
(c) हेटरोट्रोफ
(d) कीमोट्रोफ

८. ठोस माध्यम पर कॉलोनी शुद्धिकरण प्रक्रिया को सर्वप्रथम किसने विकसित किया?

(a) लुई पाश्चर
(b) रॉबर्ट कोच
(c) फैनी हेस
(d) रिचर्ड पेट्री

९. HTST और UHT विधियाँ किससे संबंधित हैं:

(a) पाश्चरीकरण
(b) शुद्ध कल्चर का पृथक्करण
(c) जीवाणु का रंजन
(d) जीवाणु का कल्चर

१०. स्वतः जनन सिद्धांत किसने प्रस्तावित किया?

(a) फ्रांसेस्को रेडी
(b) लाज़ारो स्पालंज़ानी
(c) रॉबर्ट कोच
(d) लुई पाश्चर

११. रोग का जीवाणु सिद्धांत किसने प्रस्तावित किया?

(a) फ्रांसेस्को रेडी
(b) लाज़ारो स्पालंज़ानी
(c) रॉबर्ट कोच
(d) लुई पाश्चर

१२. एक जीवाणु जनसंख्या में जिसमें जीवाणुओं की संख्या $10^{4}$ कोशिकाएँ $/ \mathrm{mL}$ से बढ़कर $10^{7}$ कोशिकाएँ $/ \mathrm{mL}$ हो जाती है, 4 घंटे के घातीय विकास के दौरान विशिष्ट विकास दर और जनन काल की गणना कीजिए।

(उत्तर: $\mu=1.72 \mathrm{hrs}^{-1}, \mathrm{t}_{\mathrm{d}}=0.4 \mathrm{~h}$ या $24 \mathrm{~min}$ )

13. अभिकथन: Saccharomyces की बैच संवर्धन द्वारा अल्कोहोल उत्पादन स्थिर रूप से घटने लगता है, भले ही तापमान जैसी स्थितियाँ इष्टतम हों।

कारण: लगभग $13 %$ अल्कोहल सांद्रता खमीर कोशिकाओं के लिए विषाक्त होती है।

(a) अभिकथन और कारण दोनों सत्य हैं और कारण अभिकथन का सही स्पष्टीकरण है।

(b) अभिकथन और कारण दोनों सत्य हैं लेकिन कारण अभिकथन का सही स्पष्टीकरण नहीं है।

(c) अभिकथन सत्य है लेकिन कारण असत्य है।

(d) अभिकथन और कारण दोनों असत्य हैं।

14. अभिकथन: Ampicillin युक्त चयन माध्यम को ऑटोक्लेव द्वारा निर्जीवित किया जाता है। $\mathrm{Amp}^{\mathrm{S}}$ और $\mathrm{Amp}^{\mathrm{R}}$ दोनों सूक्ष्मजीव माध्यम पर वृद्धि दिखाते हैं।

कारण: $\mathrm{Amp}^{\mathrm{S}}$ सूक्ष्मजीव की वृद्धि को रोकने के लिए ampicillin को ऑटोक्लेव नहीं करना चाहिए था, बल्कि माध्यम में जोड़ने से पहले सूक्ष्म-फिल्टरों का उपयोग करके निर्जीवित करना चाहिए था।

(a) अभिकथन और कारण दोनों सत्य हैं और कारण अभिकथन का सही स्पष्टीकरण है।

(b) अभिकथन और कारण दोनों सत्य हैं लेकिन कारण अभिकथन का सही स्पष्टीकरण नहीं है।

(c) अभिकथन सत्य है लेकिन कारण असत्य है।

(d) अभिकथन और कारण दोनों असत्य हैं।

15. अभिकथन: सूक्ष्मजीव तापमान की विस्तृत श्रेणी पर वृद्धि और गुणन करने में सक्षम होते हैं।

कारण: चरम थर्मोफाइल $100^{\circ} \mathrm{C}$ से अधिक तापमान को सहन कर सकते हैं।

(a) अभिकथन और कारण दोनों सत्य हैं और कारण अभिकथन का सही स्पष्टीकरण है।

(b) दोनों कथन और कारण सत्य हैं, लेकिन कारण कथन का सही स्पष्टीकरण नहीं है।

(c) कथन सत्य है, लेकिन कारण असत्य है।

(d) दोनों कथन और कारण असत्य हैं।