पशु कोशिका संवर्धन को पशु कोशिकाओं की इन विट्रो अनुरक्षण और प्रसार के रूप में वर्णित किया जाता है जो यदि उपयुक्त पोषक तत्वों और वृद्धि की परिस्थितियों से आपूर्ति की जाए तो जीवित जीवों के बाहर भी वृद्धि करती रहती हैं। प्रयोगशाला परिस्थितियों में कोशिकाओं को उगाने की प्रक्रिया को कोशिका संवर्धन कहा जाता है। इसे इन विट्रो (काँच के भीतर) में किया जाता है, न कि इन विवो (जीवित के भीतर) में। यह पशु ऊतक से कोशिकाओं के पृथक्करण, पशु से ऊतकों या अंगों को हटाने के लिए शल्य चिकित्सा हस्तक्षेप और उनकी उत्तरजीविता और प्रसार को बढ़ाने के लिए उन्हें एक वातावरण (माध्यम) में रखने से संबंधित है।

एक समरूह कोशिका जनसंख्या को एकल मूल कोशिका से प्राप्त किया जा सकता है जिसे क्लोन कहा जाता है। इसलिए, एक क्लोनल जनसंख्या के भीतर सभी कोशिकाएँ आनुवंशिक रूप से समान होती हैं। पशु कोशिकाओं की वृद्धि दर अपेक्षाकृत धीमी होती है और आमतौर पर विभाजित होने में 18 से 24 घंटे लगते हैं। यह पशु कोशिका संवर्धन को संदूषण के प्रति संवेदनशील बनाता है, क्योंकि बैक्टीरिया की थोड़ी संख्या भी पशु कोशिकाओं की बड़ी जनसंख्या को शीघ्र ही पीछे छोड़ देती है।

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हेनरिएटा लैक्स की अमर कोशिकाएँ

हेनरिएटा लैक्स नामक एक अफ्रीकी-अमेरिकी महिला को 1951 में टर्मिनल गर्भाशय ग्रीवा के कैंसर का निदान हुआ। उनका इलाज जॉन हॉपकिन्स विश्वविद्यालय में जॉर्ज गे नामक डॉक्टर द्वारा किया गया, जिन्होंने उनकी अनुमति के बिना उनकी गर्भाशय ग्रीवा से कोशिकाएँ काट लीं। गे ने पाया कि लैक्स की कोशिकाएँ न केवल जीवित रखी जा सकती हैं, बल्कि अनिश्चित काल तक वृद्धि भी की जा सकती है।

पिछले 70 वर्षों से, ‘लैक्स’ की कोशिकाओं को संवर्धित किया गया है और विभिन्न प्रयोगों में उपयोग किया गया है, जिनमें विकिरण के दीर्घकालिक प्रभावों का निर्धारण से लेकर लाइव पोलियो वैक्सीन का परीक्षण शामिल है। उनकी कोशिकाओं को व्यावसायिक बनाया गया और चिकित्सा शोधकर्ताओं ने उनके ऊतक पर पेटेंट कराकर लाखों डॉलर का लाभ अर्जित किया है।

कोशिकाओं की इष्टतम वृद्धि के लिए आवश्यक आवश्यकताएँ हैं नियंत्रित तापमान, कोशिकाओं के आसंजन के लिए उचित सब्सट्रेट, उपयुक्त वृद्धि माध्यम और एक इनक्यूबेटर जो सही $\mathrm{pH}$ और परिभाषित ओस्मोलैलिटी को बनाए रखे। कोशिका संवर्धन से कोशिका प्रसार, विभेदन और उत्पाद निर्माण के नियमन के आधार को नियंत्रित परिस्थितियों में अध्ययन करने में मदद मिलती है और इसलिए, इसने जीवन विज्ञान अनुसंधान के कई शाखाओं में प्रमुख स्थान प्राप्त कर लिया है। यह प्रौद्योगिकी अब आण्विक आनुवंशिकी, प्रतिरक्षीय विश्लेषण, सर्जरी, जैव-अभियांत्रिकी और फार्मास्युटिकल उद्योग के क्षेत्र में एक उपकरण के रूप में उभरी है।

8.1 ऐतिहासिक परिप्रेक्ष्य

पशु कोशिका संवर्धन 1950 के दशक में एक नियमित प्रयोगशाला तकनीक बन गया जब जॉर्ज गे ने हेनरीएटा लैक्स नामक रोगी के गर्भाशय ग्रीवा के कैंसर से पहली मानव कोशिका लाइन (HeLa) स्थापित की, जिससे चिकित्सा विज्ञान में कई महत्वपूर्ण खोजें हुईं। विशेष रूप से बड़े पैमाने पर कोशिका संवर्धन की आवश्यकता वायरस वैक्सीन की मांग के साथ स्पष्ट हो गई।

कोशिका संवर्धन प्रौद्योगिकियों का उपयोग विभिन्न क्षेत्रों में किया गया है, जिनमें नई दवाओं की प्रभावकारिता और विषाक्तता का आकलन, वैक्सीन और जैव-औषधियों का निर्माण आदि शामिल हैं। कोशिका संवर्धन प्रौद्योगिकी के विकास के साथ विभिन्न प्रकार के संवर्धन माध्यम तैयार किए गए हैं। संवर्धन माध्यम कोशिका जीवित रहने, विभाजन और कोशिकीय कार्यों का समर्थन करता है।

वृद्धि कारक, जैसे तंत्रिका वृद्धि कारक, एपिडर्मल वृद्धि कारक, इंसुलिन-जैसा वृद्धि कारक, फाइब्रोब्लास्ट वृद्धि कारक (FGF), प्लेटलेट-व्युत्पन्न वृद्धि कारक और ट्रांसफॉर्मिंग वृद्धि कारक (TGF) एक के बाद एक खोजे गए और उनके मिलाने से कोशिकीय विभाजन बढ़ा। 1976 में, सीरम-रहित माध्यम का विकास तेजी से बढ़ा। पशु संवर्धन के ऐतिहासिक दृष्टिकोण के लिए समयरेखा तालिका 8.1 में प्रस्तुत की गई है।

8.2 संवर्धन माध्यम

सेल कल्चर में सबसे महत्वपूर्ण और निर्णायक चरण उपयुक्त वृद्धि माध्यम का चयन होता है ताकि उनकी उचित इन विट्रो कल्चर हो सके। उपयुक्त माध्यम का चयन कल्चर किए जाने वाली कोशिकाओं के प्रकार और कल्चर की आवश्यकता, जैसे वृद्धि, विभेदन और वांछित उत्पादों (जैसे फार्मास्यूटिकल यौगिकों) के उत्पादन पर निर्भर करेगा। एक विशिष्ट कल्चर माध्यम में विटामिन, अमीनो अम्ल, ग्लूकोज, अकार्बनिक लवण, सीरम (वृद्धि कारकों के स्रोत के रूप में) और हार्मोनों की एक संपूर्ण मात्रा होती है। इसके अतिरिक्त, माध्यम $\mathrm{pH}$ और ऑस्मोलैलिटी को बनाए रखने में मदद करता है। माध्यम प्राकृतिक या संश्लेषित/कृत्रिम हो सकते हैं, साथ ही कुछ प्राकृतिक वृद्धि कारक भी पशु कोशिकाओं को कल्चर करने के लिए होते हैं (तालिका 8.2)।

माध्यम पूरक

जैसा कि आप जानते हैं, कल्चर माध्यम में अमीनो अम्ल, लवण, ग्लूकोज, विटामिनों का संयोजन होता है, अन्य पोषक तत्वों के साथ पूरक होता है। इन घटकों की आवश्यकता उन कोशिका लाइनों पर आधारित होती है जिन्हें कल्चर किया जाना है, और इस प्रकार, कई प्रकार के माध्यम सूत्र उपलब्ध हैं।

कुछ अतिरिक्त घटक (हार्मोन, वृद्धि कारक और सिग्नलिंग पदार्थ), जो आधारभूत माध्यम और सीरम में मौजूद नहीं होते, आवश्यक होते हैं जो कोशिका प्रसार और सामान्य कोशिका चयापचय को बनाए रखने में मदद करते हैं।

सीरम

सीरम सेल कल्चर मीडिया के सबसे महत्वपूर्ण घटकों में से एक है। सीरम को अमीनो अम्ल, प्रोटीन, विटामिन, कार्बोहाइड्रेट, लिपिड, हार्मोन, ग्रोथ फैक्टर आदि का एक अच्छा स्रोत माना जाता है। सीरम कई बाइंडिंग प्रोटीन, जैसे एल्ब्यूमिन, ट्रांसफरिन प्रदान करता है, जो अन्य अणुओं को कोशिका में ले जा सकते हैं। इसके अतिरिक्त, सीरम एडहेसन फैक्टर भी सप्लीमेंट करता है जो कोशिकाओं को सब्सट्रेट से चिपकने में मदद करता है इससे पहले कि वे विभाजित होना शुरू करें। भ्रूण और बछड़े

तालिका 8.1: पशु ऊतक संवर्धन का ऐतिहासिक दृष्टिकोण

नाम	वर्ष	सफलता
सिडनी रिंगर	1882	शरीर के द्रवों के समान संघटन वाला संतुलित लवण विलयन और मेंढक के दिलों को विच्छेदन और शरीर से निकालने के बाद रखा
रू	1885	गर्म लवण पर चिकन भ्रूण की मज्जा प्लेट
जॉली	1903	सैलामैंडर के श्वेत रक्त कोशिकाओं में इन विट्रो कोशिका जीवित रहना और कोशिका विभाजन
रॉस हैरिसन	1907	मेंढक भ्रूण की तंत्रिका तंतु की इन विट्रो वृद्धि दिखाने वाले प्रयोग प्रकाशित किए
लुइस और लुइस	1911	- संयोजी ऊतक कोशिकाओं को लंबे समय तक संवर्धित किया और हृदय पेशी ऊतक की संकुचन क्षमता को $2-3$ महीनों तक दिखाया
		- पहला द्रव माध्यम समुद्र जल, सीरम, भ्रून अर्क, लवण और पेप्टाइड्स से बना था
अलेक्सिस कैरेल	1912	ऊतक संवर्धन के लि‍ए साफ-सुथरी तकनीकें। ट्रिप्सिन, भ्रून अर्क/पशु सीरम का प्रयोग
रूस और जोन्स	1913	एंटीबायोटिक्स: पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन का प्रयोग
	1916	लैमिनार एयर-फ्लो कैबिनेट्स का प्रयोग
	1940	समान कोशिका तनाव उत्पन्न करने के लिए ट्रिप्सिनाइज़ेशन; ऊतक संवर्धन माध्यम
	1950	वातावरण: तापमान, ओपी, पीएच, आवश्यक उपापचयी, अकार्बनिक आयन, हार्मोन, बाह्यकोशिका मैट्रिक्स
कैथरीन सैनफोर्ड, एट अल	1940 के दशक- $50 \mathrm{~s}$	माउस एल-कोशिकाओं को क्लोन करने वाले पहले। ट्यूमर कोशिकाएं निरंतर कोशिका रेखाएं दे सकती हैं। कैंसरकारी/वायरस के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए गैर-कैंसरयुक्त रोडेंट कोशिका संवर्धन का प्रयोग किया।
मार्गरेट गे और जॉर्ज गे	1948	फाइब्रोब्लास्टों में संपर्क निरोधन देखा - मात्रात्मक कोशिका संवर्धन प्रयोग की शुरुआत
अबरक्रॉम्बी और हीज़मै	1952	मानव ई-कोशिकाओं में पोलियो वायरस; पोलियो वैक्सीन का उत्पादन
एंडर्स, एट अल	1954	वैक्सीन उत्पादन के लिए मानव कोशिका रेखाएं - मानव और पशु चिकित्सा
हेफ़लिक और मूरहेड	1955	सामान्य मानव द्विगुणित कोशिकाओं की सीमित जीवनकाल का वर्णन किया।
	1961	विभेदित कोशिकाओं (ट्यूमर उत्पत्ति) को बनाए रखने की विधियाँ प्रकाशित कीं
हैरी ईगल	1962	परिभाषित माध्यम विकसित किए
	1970	संलग्नक कारक और फीडर परतों का वर्णन किया
बुओनासिसि, एट अल	1962	इन विट्रो में सामान्य मायोब्लास्टों के विभेदन का अध्ययन किया
लिटलफील्ड	1964	एचएटी चयन
डेविड याफे	1968	मानव भ्रूण फेफड़े फाइब्रोब्लास्ट
कोहलर और मिलस्टीन	1975	मोनोक्लोनल एंटीबॉडी स्क्रीन करने में सक्षम पहला हाइब्रिडोमा

तालिका 8.2: विभिन्न प्रकार के माध्यम

श्रेणी	परिभाषा	प्रकार	विवरण	नुकसान/ लाभ
प्राकृतिक माध्यम	प्राकृतिक जैविक पदार्थों, जैसे प्लाज्मा, सीरम और भ्रूण अर्क से बना होता है	थक्का या जमावट	हेपरिनयुक्त रक्त से पृथक किया गया प्लाज्मा, सीरम और फाइब्रिनोजन	प्राकृतिक माध्यमों का सबसे बड़ा नुकसान खराब पुनरावृत्तीयता और घटी एकरूपता है क्योंकि इन प्राकृतिक माध्यमों की सटीक संरचना ज्ञात नहीं होती।
		ऊतक अर्क	चिकन भ्रूण, लीवर, तिल्ली और अस्थि मज्जा के अर्क
		जैविक द्रव	प्लाज्मा, सीरम, लिम्फ, एम्नियोटिक द्रव और प्लूरल द्रव
संश्लेषित माध्यम या कृत्रिम माध्यम	एक आधारभूत माध्यम और पूरक, जैसे सीरम, वृद्धि कारक और हार्मोन से बना होता है	सीरम-युक्त माध्यम	मानव, गोवंश, घोड़ा या अन्य सीरम पूरक के रूप में प्रयुक्त होता है	सीरम की गुणवत्ता बैच से बैच में भिन्न होती है और एक वर्ष के भीतर खराब हो जाती है। इसलिए हर बैच की ताजा जांच आवश्यक होती है।
		सीरम-रहित माध्यम	कच्चे प्रोटीन अंश, जैसे गोवंश सीरम एल्ब्यूमिन या α- या β-ग्लोब्यूलिन, पूरक के रूप में प्रयुक्त होते हैं	यह किसी विशेष कोशिका प्रकार के लिए माध्यम को चयनात्मक बनाने की क्षमता रखता है, क्योंकि प्रत्येक कोशिका प्रकार को भिन्न नुस्खा लगता है।
		जीनो-रहित माध्यम	मानव स्रोत घटक, जैसे मानव सीरम एल्ब्यूमिन, पूरक के रूप में प्रयुक्त होते हैं परंतु पशु घटकों को पूरक के रूप में अनुमति नहीं होती
		प्रोटीन-रहित माध्यम	अपरिभाषित घटक, जैसे पेप्टाइड अंश (प्रोटीन हाइड्रोलाइज़ेट), पूरक के रूप में प्रयुक्त होते हैं
		रासायनिक रूप से परिभाषित माध्यम	आधारभूत माध्यम फॉस्फेट बफर्ड सैलाइन (PBS), डलबेको का फॉस्फेट बफर्ड सैलाइन (DPBS), हैंक का संतुलित लवण विलयन (HBSS), अर्ल का संतुलित लवण विलयन (EBSS)	संतुलित लवण विलयन (BSS) अकार्बनिक लवणों से बना होता है जो शारीरिक pH और परासरणीय दाब बनाए रखते हैं। अकार्बनिक आयनों की शारीरिक भूमिका झिल्ली विभव बनाए रखना है।
			जटिल माध्यम - ईगल का न्यूनतम आवश्यक माध्यम (EMEM) - डलबेको का न्यूनतम आवश्यक माध्यम, - रॉज़वेल पार्क मेमोरियल संस्थान (RPMI-1640), - हैम का पोषक मिश्रण (Ham’s F-12)	ये एंजाइम अभिक्रिया में सहकारक और कोशिका आसंजन में भी कार्य करते हैं। Na⁺, K⁺, Mg²⁺, Ca²⁺, Cl⁻, SO₄²⁻, PO₄³⁻ और HCO₃⁻ संलग्न अकार्बनिक अणु हैं। परासरणीयता बनाए रखने के लिए NaCl की सांद्रता सामान्यतः समायोजित की जाती है।

बोवाइन सीरम को सामान्यतः संस्कृति में कोशिकाओं की वृद्धि को समर्थन देने के लिए प्रयोग किया जाता है।

हालांकि, मीडिया में सीरम के कुछ नुकसान होते हैं:

• सीरम में कोशिका-विशिष्ट वृद्धि कारकों की अपर्याप्त मात्रा होती है और इस प्रकार इसे संस्कृति के लिए अकेले प्रयोग नहीं किया जा सकता।
• इसमें कुछ साइटोटॉक्सिक यौगिक और वृद्धि-निरोधक कारक भी हो सकते हैं जो संस्कृत कोशिकाओं की वृद्धि और प्रसार को रोकेंगे।
• सीरम में विभिन्न वायरस, कवक और माइकोप्लाज़्मा जैसे उच्च जोखिम वाले दूषित पदार्थ हो सकते हैं।
• संस्कृति मीडिया में मौजूद सीरम कोशिका संस्कृति उत्पादों—जिनमें फार्मास्यूटिकल यौगिक भी शामिल हैं—की शुद्धि और पृथक्करण में बाधा डाल सकता है और इसलिए कोशिका संस्कृति उत्पादों के पृथक्करण के लिए कुछ अतिरिक्त दृष्टिकोण अपनाए जाते हैं।

एंटीबायोटिक्स

यद्यपि कोशिकाओं की वृद्धि के लिए आवश्यक नहीं हैं, पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन जैसे एंटीबायोटिक्स का प्रयोग संस्कृति माध्यम में बैक्टीरिया और कवक जैसे दूषित पदार्थों की वृद्धि को नियंत्रित करने के लिए सामान्य है।

8.3 पशु कोशिकाओं की संस्कृति के लिए भौतिक वातावरण

इन विट्रो परिस्थितियों में पशु कोशिका संस्कृति में कोशिकाओं की इष्टतम वृद्धि सक्षम करने के लिए उपयुक्त सूक्ष्म-वातावरण, पोषण, भौतिक और हार्मोनल परिस्थितियों की नकल करना शामिल होता है। इसलिए तापमान, ऑस्मोलैलिटी, $\mathrm{pH}$, गैसीय आवश्यकताओं, एक सहायक सतह का नियंत्रण और कोशिकाओं को भौतिक, रासायनिक और यांत्रिक तनावों से सुरक्षा देना आवश्यक है।

तापमान

$\mathrm{CO}_{2}$ इनक्यूबेटर स्तनधारी कोशिकाओं को $37^{\circ} \mathrm{C}$ पर बढ़ाने के लिए उपयोग किए जाते हैं, क्योंकि यह तापमान होमो सेपियन्स के शरीर के तापमान का अनुकरण करता है। इसके अतिरिक्त, अधिकांश कोशिकाएं गर्म खून वाले जानवरों से प्राप्त की गई हैं जो इस तापमान पर इष्टतम रूप से बढ़ती हैं।

ओस्मोलैलिटी

माध्यम की ओस्मोलैलिटी का कोशिका वृद्धि और कार्य पर पर्याप्त प्रभाव पड़ता है। यह कोशिका झिल्लियों की अखंडता बनाए रखती है। यदि बाहर का ओस्मोटिक दबाव कोशिका के अंदर बनाए रखे गए दबाव से कम या अधिक हो जाता है, तो कोशिका तदनुसार फूलेगी या सिकुड़ेगी। उपयोग किए जाने वाले माध्यम की ओस्मोलैलिटी मीडिया के सूत्रण द्वारा निर्धारित की जाती है। ग्लूकोज और नमक दोनों ही माध्यम की ओस्मोलैलिटी के प्रमुख योगदानकर्ता हैं, यद्यपि अमीनो अम्ल भी काफी योगदान देते हैं। आमतौर पर, सभी वाणिज्यिक मीडिया इस प्रकार सूत्रित किए जाते हैं कि उनकी अंतिम ओस्मोलैलिटी लगभग $300 \mathrm{mOsmol}$ हो। ओस्मोलैलिटी को एक ओस्मोमीटर द्वारा मापा जा सकता है।

बफरिंग प्रणालियाँ

इष्टतम संवर्धन परिस्थितियों के लिए, $\mathrm{pH}$ का नियमन महत्वपूर्ण है और इसे निम्नलिखित बफरिंग प्रणालियों में से किसी एक द्वारा प्राप्त किया जाता है:

(A) प्राकृतिक बफरिंग प्रणाली

प्राकृतिक बफरिंग प्रणाली में, गैसीय $CO_2$ संवर्धन माध्यम की $CO_2 / HCO_3^-$ सामग्री के साथ संतुलन बनाता है। $CO_2, HCO_3^-$ और $\mathrm{pH}$ की सांद्रताएं परस्पर संबंधित होती हैं। बाह्य/बाह्योत्पन्न $CO_2$ को बढ़ाकर, $pH$ घट जाएगा जिससे माध्यम अम्लीय हो जाएगा।

प्राकृतिक बफरिंग प्रणाली वाले संवर्धन माध्यम को 5-10 प्रतिशत CO₂ वाली हवा में बनाए रखना होता है, जिसे सामान्यतः CO₂ इनक्यूबेटर द्वारा नियंत्रित किया जाता है। प्राकृतिक बफरिंग प्रणाली कम लागत वाली और अ-विषैली होती है। माध्यम में पायरुवेट की उपस्थिति से कोशिकाओं द्वारा CO₂ का अंतःस्रावी उत्पादन बढ़ जाता है। इस प्रकार, पायरुवेट का उपयोग इसलिए लाभप्रद है क्योंकि इससे बाह्य CO₂ आपूर्ति पर निर्भरता कम हो जाती है।

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बाइकार्बोनेट बफरिंग ले शातेलिए सिद्धांत का अनुसरण करती है। माध्यम में अम्लता में वृद्धि हाइड्रोजन (H⁺) आयनों की वृद्धि द्वारा स्थापित होती है; मुक्त बाइकार्बोनेट आयन तब अतिरिक्त H⁺ आयनों से अभिक्रिया कर कार्बोनिक अम्ल बनाते हैं, ‘अभिक्रिया को बाईं ओर स्थानांतरित करते हैं’, pH को स्थिर करते हैं। इसी प्रकार, H⁺ आयनों में कमी ‘दाईं ओर स्थानांतरण’ का परिणाम होगी।

(B) रासायनिक बफरिंग प्रणाली

रासायनिक बफरिंग प्रणाली में, एक ज़्विटर आयन, 4-(2-हाइड्रॉक्सीएथिल)-1-पिपेरेज़ीनेथेनसल्फोनिक अम्ल (HEPES), का उपयोग किया जाता है जिसकी pH सीमा 7.2-7.4 में उत्कृष्ट बफरिंग क्षमता होती है, और HEPES के साथ नियंत्रित गैसीय वातावरण की आवश्यकता नहीं होती है। यह अपेक्षाकृत महंगा है और कुछ कोशिका प्रकारों के लिए उच्च सांद्रता में विषैली हो सकती है।

फ़ीनॉल रेड

फ़िनॉल रेड आमतौर पर वाणिज्यिक माध्यमों में $\mathrm{pH}$ संकेतक के रूप में प्रयोग किया जाता है। इसका प्रभावी रूप से उपयोग कोशिका वृद्धि के दौरान चयापचयी गतिविधियों के कारण $\mathrm{pH}$ परिवर्तन की निगरानी के लिए किया जाता है। फ़िनॉल रेड की उपस्थिति के कारण, $\mathrm{pH}$ बदलने पर माध्यम अपना रंग बदलता है। अम्लीय $\mathrm{pH}$ स्तरों पर, फ़िनॉल रेड माध्यम को पीला बना देता है, जबकि क्षारीय $\mathrm{pH}$ स्तरों पर माध्यम गुलाबी हो जाता है। इष्टतम $\mathrm{pH}-7.4$ पर माध्यम चमकदार लाल होता है। (चित्र 8.1)

चित्र 8.1: (a) फ़िनॉल रेड की संरचना, (b) $\mathrm{pH}$ संकेतक के रूप में फ़िनॉल रेड

8.4 कोशिका संवर्धन के लिए प्रयुक्त उपकरण

संवर्धनों को बनाए रखा जाना चाहिए और माध्यम के रंग को समझने के लिए रोज़ाना जांचा जाना चाहिए ताकि उनकी आकृति विज्ञान और कोशिकाओं की सघनता को समझा जा सके जो संवर्धन फ्लास्क, पेट्री डिशों या कई आकारों और आकृतियों के बहु-कुएं प्लेटों (चित्र 8.2) में उचित तापमान, आर्द्रता और गैस मिश्रण (आमतौर पर, स्तनधारी कोशिकाओं के लिए $37^{\circ} \mathrm{C}, 95 %, 5 % \mathrm{CO}_{2}$) पर एक इनक्यूबेटर में क्रमशः विकसित की जाती हैं। संवर्धन की स्थितियाँ प्रत्येक कोशिका प्रकार के लिए काफी भिन्न होती हैं, और किसी विशेष कोशिका प्रकार के लिए इन स्थितियों में परिवर्तन परिवर्तित प्रकार्यविधियों की अभिव्यक्ति का परिणाम हो सकता है।

चित्र 8.2: (a) कल्चर फ्लास्क, माइक्रोप्लेट्स और पेट्री डिश, (b) सेल स्क्रेपर

एक आदर्श पशु कोशिका संवर्धन प्रयोगशाला में लैमिनर हुड, $\mathrm{CO}_{2}$ इनक्यूबेटर, उल्टा सूक्ष्मदर्शी, ऑटोक्लेव, सेंट्रीफ्यूज आदि उपकरण होने चाहिए। इन पर निम्नलिखित खंडों में चर्चा की गई है।

लैमिनर फ्लो हुड या बायोसेफ्टी कैबिनेट

पशु ऊतक या कोशिका संवर्धन को बिना किसी जीवाणु या कवक संदूषण के, अर्थात् पूर्णतः असंक्रमित रूप से संभाला जाना चाहिए और सम्पूर्ण कार्य इसी प्रकार सम्पन्न किया जाना चाहिए। लैमिनार प्रवाह कैबिनेट (चित्र 8.3) एक नियंत्रित वातावरण प्रदान करता है जिसमें कणों, सूक्ष्मजीवों और सभी प्रकार के संदूषण के स्तर को नियंत्रित किया जाता है और औद्योगिक-ग्रेड फिल्टरों द्वारा निरंतर वायु छानकर न्यूनतम स्तर पर रखा जाता है। लैमिनार हूड नकारात्मक दाब के अन्तर्गत ऊपर से वायु को खींचकर कार्य करते हैं। यह वायु प्रारम्भ में एक प्री-फिल्टर से होकर गुजरती है जो धूल और गंदगी के बड़े कणों को फँसा लेता है। फिर ब्लोवर इस प्री-फिल्टर्ड वायु को, जो अब धनात्मक दाब में है, 99.99 प्रतिशत कुशल HEPA फिल्टर के माध्यम से पूरे कार्य क्षेत्र को बाँध देता है जिससे वहाँ निर्जीव, एकदिशीय, अत्यंत स्वच्छ वायु व्याप्त हो जाती है। यह वायु इस गति से चलती है जिससे कार्य क्षेत्र में बिना छने कमरे की वायु के प्रवेश को रोका जा सके। लैमिनार प्रवाह कैबिनेट सामान्यतः दोनों ओर से बन्द होता है और निरंतर धनात्मक दाब में रखा जाता है ताकि संदूषित कमरे की वायु के भीतर आने से रोका जा सके। ऐसे कैबिनेट अन्दर ली गई वायु को फिल्टर द्वारा निर्जीव करते हैं, इस प्रकार जीवाणु और कवक जैसे बड़े कणों को बाहर रखते हैं। इस प्रकार निर्जीव की गई वायु कार्य क्षेत्र पर ऊर्ध्वाधर नीचे की ओर बहती है — ऊर्ध्वाधर (डाउन-फ्लो) प्रवाह हूड (चित्र 8.3(b))। जब वायु क्षैतिज रूप से संचालक की ओर निर्देशित की जाती है, तो इसे क्षैतिज (क्रॉस-फ्लो) कहा जाता है।

चित्र 8.3: लैमिनार फ्लो हुड (a) क्षैतिज (b) ऊर्ध्वाधर

फ्लो हुड (चित्र 8.3(a))। क्षैतिज फ्लो हुड लोकप्रिय नहीं हैं क्योंकि ये कुछ संवर्धित कोशिकाओं की संभावित खतरों से संचालक को कोई सुरक्षा नहीं देते। निर्जीव, कण-रहित वायु ऐसे विविध प्रसंस्करण क्षेत्रों में आवश्यक है जैसे इलेक्ट्रॉनिक असेंबली, निर्जीव पैकेजिंग और अस्पताल फार्मेसी के इंट्रावेनस (I.V.) तैयारी।

$CO_2$ इनक्यूबेटर कोशिका संवर्धन कार्य के लिए इनक्यूबेटर बाहरी $CO_2$ आपूर्ति पर निर्भर करते हैं ताकि इनक्यूबेटर में $CO_2$ की एक निश्चित स्तर बनाए रखा जा सके। निर्जीव हैंडलिंग क्षेत्र और स्वच्छता बनाए रखने के लिए, $CO_2$ सिलेंडर को प्रयोगशाला के बाहर रखा जाना चाहिए और गैस को पाइप के माध्यम से भेजा जाना चाहिए। इनक्यूबेटर के आवश्यक कार्य कक्ष की निर्जीवता, एक स्थिर तापमान, $5-10 %$ स्तर वाला $CO_2$ वाला वातावरण और उच्च सापेक्ष आर्द्रता (95%) बनाए रखना हैं (चित्र 8.4)। माध्यम को सोडियम बाइकार्बोनेट/कार्बोनिक अम्ल के साथ और बफर किया जाता है और $\mathrm{pH}$ को सख्ती से बनाए रखना होता है।

चित्र 8.4: $\mathrm{CO}_{2}$

उल्टा सूक्ष्मदर्शी

एक कोशिका संवर्धन प्रयोगशाला के लिए अनिवार्य रूप से एक उच्च गुणवत्ता वाला उल्टा सूक्ष्मदर्शी (inverted microscope) चाहिए जिसमें फेज-कॉन्ट्रास्ट ऑप्टिक्स हो और अगर संभव हो तो फोटोग्राफी की सुविधा भी हो (चित्र 8.5)। कोशिका की आकृति, कणिकापन, फैलाव की डिग्री, झिल्ली की उभरी हुई बनावट, बहु-केन्द्रकीय कोशिकाओं की अनुपात, रिक्तिकापन आदि को नियमित रूप से निगरानी में रखा जा सकता है ताकि कोशिकाओं में तनाव के संकेतों को समझा जा सके। कोशिका की आकृति संवर्धन परिस्थितियों में बदलाव के प्रति संवेदनशील होती है, इसलिए समस्याओं को आसानी से पकड़ा जा सकता है। एक अच्छे फेज-कॉन्ट्रास्ट सूक्ष्मदर्शी से सूक्ष्मजीवीय संदूषण के प्रारंभिक संकेतों को भी देखा जा सकता है। संवर्धनों को सूक्ष्मदर्शी के तहत नियमित रूप से जाँचने से कोई समस्या प्रारंभिक चरण में ही दिख जाती है जिससे अप्रतिस्थापनीय सामग्री के नुकसान से बचा जा सकता है। इसके अतिरिक्त, अस्वस्थ कोशिकाओं पर किए गए प्रयोग परिवर्तनशील या गलत परिणाम दे सकते हैं। सूक्ष्मदर्शी चुनते समय लंबे या अतिरिक्त लंबे कार्य-दूरी वाले कंडेनसर का चयन करें ताकि फ्लास्क और यहां तक कि रोलर बोतलों को भी देखा जा सके। सामान्यतः 20 x आवर्धन वाला उद्देश्य पर्याप्त होता है; इनकी गहराई का क्षेत्र अक्सर इतना कम होता है कि केवल सबसे चपटी कोशिकाओं की ही तीक्ष्ण छवि प्राप्त होती है। एक अच्छा, कम-आवर्धन, विस्तृत-क्षेत्र वाला उद्देश्य संवर्धन कॉलोनियों को स्कैन करने के लिए अत्यंत उपयोगी होता है।

चित्र: 8.5: उल्टा सूक्ष्मदर्शी

8.5 प्रकार के पशु कोशिका संवर्धन और कोशिका रेखाएँ

पशु कोशिका संवर्धन और कोशिका रेखाओं को व्यापक रूप से प्राथमिक और द्वितीयक कोशिका संवर्धन और कोशिका रेखाओं के रूप में वर्गीकृत किया जाता है।

(i) प्राथमिक कोशिका संवर्धन

प्राथमिक कोशिका संवर्धन सीधे मेजबान ऊतक से प्राप्त किया जाता है।

माता-पिता या मेजबान ऊतकों से पृथक की गई कोशिकाओं को एक उपयुक्त संवर्धन माध्यम में एक कंटेनर में उगाया जाता है और इस प्रकार प्राप्त संवर्धन को प्राथमिक कोशिका संवर्धन कहा जाता है। इस प्रकार के संवर्धन में ज्यादातर विषम कोशिकाएँ होती हैं और ये कोशिकाएँ अपने माता-पिता के समान होती हैं और इन्हें प्राथमिक कोशिका रेखाएँ कहा जाता है। प्राथमिक संवर्धन और कोशिका रेखाओं की तैयारी के लिए, एक ऊतक को बेस्टर स्थितियों में विच्छेदित किया जाता है और फिर यांत्रिक या एंजाइमेटिक विघटन किया जाता है। ऊतक को सरलता से काटा जा सकता है और टुकड़ों को एक डिश से जोड़ा जा सकता है। अब टुकड़े से कोशिकाएँ बाहर निकलकर बढ़ेंगी और सीधे संवर्धन के लिए उपयोग की जा सकती हैं। ऊतक के टुकड़े को एक्सप्लांट कहा जाता है जिसे एक नई डिश में स्थानांतरित किया जा सकता है। प्राथमिक संवर्धन ऊतक को ट्रिप्सिन या कोलेजनेज़ आदि जैसे एंजाइमों की सहायता से विघटित करके भी बनाए जा सकते हैं, और कोशिका निलंबन को चिपकने और सब्सट्रेट पर फैलने दिया जाता है। कोशिकाएँ चिपचित संवर्धन के रूप में बढ़ सकती हैं या निलंबन में रह सकती हैं।

चिपचित कोशिकाएँ

ये कोशिकें आधार-आश्रित होती हैं और एकल परत के रूप में प्रस्फुटित होती हैं तथा प्रस्फुटन के लिए ठोस या अर्ध-ठोस आधार से चिपकना आवश्यक होता है। ये कोशिकाएँ बाह्य-कोशिकीय आधार की सहायता से संवर्धन पात्र से चिपक जाती हैं, जो आमतौर पर ऐसे ऊतकों से प्राप्त होता है जो गतिहीन होते हैं और संयोजी ऊतक के जाल में मौजूद होते हैं; उदाहरण हैं फाइब्रोब्लास्ट और उपकला कोशिका प्रकार। जैसे ही संवर्धन पात्र की तली एकल कोशिका मोटाई वाली सतत परत से ढक जाती है, इन्हें एकल-परत संवर्धन कहा जाता है। अधिकांश निरंतर कोशिका रेखाएँ एकल-परत के रूप में बढ़ती हैं। चूँकि ये एकल परतें होती हैं, ऐसी कोशिकाओं को सीधे कवर स्लिप पर स्थानांतरित कर माइक्रोस्कोप के अंतर्गत परीक्षित किया जा सकता है।

निलंबन कोशिकाएँ

निलंबन कोशिकाएँ, जिन्हें आधार-स्वतंत्र या अ-आसंजी कोशिकाएँ भी कहा जाता है, संवर्धन पात्र की सतह से चिपकती नहीं हैं और संवर्धन माध्यम में तैरती रहती हैं। रक्त, तिल्ली और अस्थि-मज्जा से प्राप्त हेमेटोपोएटिक स्टेम कोशिकाएँ और ट्यूमर कोशिकाएँ निलंबन कोशिकाओं के उदाहरण हैं। ये कोशिकाएँ तेजी से बढ़ती हैं, क्योंकि इन्हें संवर्धन माध्यम को बार-बार बदलने की आवश्यकता नहीं होती और ये प्रकृति में समांगी होती हैं।

(ii) द्वितीयक कोशिका संवर्धन

जब एक प्राथमिक संस्कृति को सब-कल्चर या पैसेज किया जाता है, तो परिणामी संस्कृति को द्वितीयक कोशिका संस्कृति कहा जाता है। सब-कल्चरिंग के दौरान, कोशिकाओं का एक भाग एक नए बर्तन में स्थानांतरित किया जाता है जिसमें ताजा वृद्धि माध्यम होता है ताकि कोशिकाओं की निरंतर वृद्धि होती रहे। प्राथमिक कोशिकाओं की सब-कल्चरिंग से द्वितीयक कोशिका लाइनों का निर्माण होता है। पैसेज के दौरान, उच्चतम वृद्धि क्षमता वाली कोशिकाएं प्रभावी होती हैं, जिससे जनसंख्या में जीनोटाइपिक और फीनोटाइपिक समरूपता आती है। जैसे-जैसे कोशिकाओं को नियमित अंतरालों पर सब-कल्चर किया जाता है, वे मूल कोशिका से भिन्न हो सकती हैं।

संस्कृति के जीवनकाल के आधार पर, कोशिका लाइनों को दो प्रकारों में वर्गीकृत किया गया है:

(क) परिमित कोशिका लाइनें

वे कोशिका लाइनें जिनकी कोशिका विभाजन की संख्या सीमित होती है और जिनका जीवनकाल सीमित होता है, उन्हें परिमित कोशिका लाइनें कहा जाता है। जैसे-जैसे कोशिकाएं कई बार पास होती हैं, वे प्रसार करने की क्षमता खो देती हैं (अर्थात्, जराच्युति)। सामान्य कोशिकाओं की प्राथमिक संस्कृतियों से व्युत्पन्न कोशिका लाइनें परिमित कोशिका लाइनें होती हैं।

(ख) निरंतर कोशिका लाइनें

कुछ सीमित कोशिका रेखा की कोशिकाएं रूपांतरण से गुजरती हैं और अनिश्चित काल तक विभाजित होने की क्षमता को पुनः प्राप्त कर लेती हैं, और एक सतत कोशिका रेखा बन जाती हैं। इस प्रकार का रूपांतरण या उत्परिवर्तन स्वतः हो सकता है या रासायनिक रूप से या वायरस के माध्यम से प्रेरित किया जा सकता है। इस तरह तैयार की गई कोशिका संस्कृतियों को उप-संस्कृति के रूप में अनिश्चित काल तक स्थायी कोशिका रेखाओं के रूप में विकसित किया जा सकता है और ये अमर और ट्यूमरजनिक होती हैं। सतत कोशिका रेखाएं कम चिपचिपी होती हैं और निलंबन में भी विकसित हो सकती हैं; ये तेजी से बढ़ने वाली, पोषक तत्वों के लिए कम मांग वाली और उच्च कोशिका घनत्व तक विकसित होने में सक्षम होती हैं।

स्वच्छ तकनीकें

कोशिका संस्कृति में, माइकोप्लाज़्मा जैसे जीवाणु संक्रमण और कवक संक्रमण सामान्य रूप से होते हैं जो समस्याएं पैदा करते हैं। इस प्रकार, सभी कोशिका संस्कृति कार्य कड़ाई से निर्जीव वातावरण में उचित स्वच्छ तकनीकों के साथ किए जाते हैं। संस्कृति से संबंधित सभी कार्य लैमिनर फ्लो में किए जाने चाहिए जहाँ कार्य क्षेत्र पर HEPA फ़िल्टर किया हुआ हवा का निरंतर एकदिशीय प्रवाह होता है। सभी सामग्री, विलयन और पूरा वातावरण निर्जीव और संदूषण मुक्त होना चाहिए।

उप-संस्कृति

कोशिकाओं के पृथक्करण और बाद में संवर्धन के बाद, कोशिकाएँ उपयुक्त परिस्थितियों में प्रसारित हो सकती हैं और वे उपलब्ध सब्सट्रेट से चिपककर संपृक्ति तक पहुँचती हैं। कुछ दिनों बाद, कोशिकाएँ एकल परत बनाती हैं और अत्यधिक बढ़कर भीड़भाड़ वाली हो जाती हैं, और यह उनकी वृद्धि के लिए अनुकूल नहीं होता, जिससे कोशिका मृत्यु हो सकती है। इस बिंदु पर, कोशिकाओं को उपसंवर्धन या पैसेजिंग की आवश्यकता होती है जो ट्रिप्सिन जैसे एंजाइम का उपयोग कर कोशिकाओं को पुराने माध्यम से अलग करने की प्रक्रिया है। फिर इसे हटा दिया जाता है और कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूगेशन और ताजा माध्यम डालने के बाद एक ताजे फ्लास्क में स्थानांतरित किया जाता है। इसे सामान्यतः ‘स्प्लिटिंग’ कहा जाता है क्योंकि एक फ्लास्क की कोशिकाओं को समान रूप से दो फ्लास्कों में संवर्धन के लिए विभाजित किया जाता है। एक पैसेज संख्या विशेष रूप से उस बार की संख्या को दर्शाती है जब एक कोशिका रेखा को उपसंवर्धित किया गया है। चिपकने वाली कोशिकाओं के उपसंवर्धन के लिए, पहले सभी कोशिकाओं को संवर्धन पोत की सतह से एंजाइमेटिक (ट्रिप्सिन, ट्रिप्सिन + कोलेजनेज आदि) या यांत्रिक साधनों (कोशिका स्क्रेपर, हिलाना, जोरदार पिपेटिंग आदि) द्वारा अलग/वियोजित किया जाता है और उसके बाद उन्हें ताजा माध्यम में स्थानांतरित किया जाता है।

एक बार कोशिका रेखा स्थापित हो जाने के बाद, उसका कैरियोटाइप निर्धारित किया जाना चाहिए। यह मूल प्रजाति की पुष्टि करेगा, विशेष रूप से उन कोशिकाओं के लिए जिन्हें कैरियोटाइप किया गया था, और रेखा में सकल गुणसूत्रीय परिवर्तनों की सीमा निर्धारित की जाएगी। कैरियोटाइप निकट-सामान्य (अर्थात्, संस्कृति में अधिकांश कोशिकाओं का सामान्य कैरियोटाइप होना) से लेकर ऐन्यूप्लॉइड तक भिन्न हो सकते हैं। यद्यपि सामान्य कैरियोटाइप वांछनीय है, असामान्य कैरियोटाइप की उपस्थिति कोशिकाओं को इन विट्रो अध्ययनों के लिए उपयोग करने की संभावना को समाप्त नहीं करती, विशेष रूप से यदि यह सत्यापित किया गया है कि कोशिकाओं से अपेक्षित सामान्य कार्य बना हुआ है। यदि सामान्य कैरियोटाइप आवश्यक है जैसे कि कोशिका रेखाओं का उपयोग ट्रांसजेनिक जानवर बनाने के लिए किया जाना है, तो गुणसूत्रीय परिवर्तनों को न्यूनतम करने के लिए कोशिकाओं को संभालने में विशेष सावधानी बरती जानी चाहिए। कैरियोटाइप स्थिरता उस प्रजाति पर निर्भर करती है जहाँ से कोशिका रेखाएँ प्राप्त की गई हैं, उपयोग की गई वृद्धि परिस्थितियों पर, कोशिकाओं को उप-संस्कृत किए जाने के तरीके पर और यह पर बात कि कोशिकाओं को जमाया गया था या नहीं।

क्रायोप्रेज़र्वेशन

बहुत कम तापमान $\left(-180^{\circ} \mathrm{C}\right.$ से $\left.-196^{\circ} \mathrm{C}\right)$ कोशिकाओं को संग्रहित करने के लिए आवश्यक होते हैं। तरल नाइट्रोजन का उपयोग कोशिकाओं को कम तापमान पर जमाने के लिए किया जाता है क्योंकि $-130^{\circ} \mathrm{C}$ से नीचे बर्फ के क्रिस्टलों का निर्माण कम हो जाता है। जमाने से कोशिका मृत्यु हो सकती है क्योंकि बर्फ के क्रिस्टलों के निर्माण से नुकसान, इलेक्ट्रोलाइट सांद्रता में परिवर्तन, निर्जलीकरण और $\mathrm{pH}$ परिवर्तन होते हैं। जमाने के प्रभावों को शून्य करने के लिए, ग्लिसरॉल या डाइमेथिल सल्फॉक्साइड (DMSO) जो क्रायोप्रोटेक्टिव एजेंट हैं, जोड़े जाते हैं। आमतौर पर, जमाने वाला माध्यम 90 प्रतिशत सीरम और 10 प्रतिशत DMSO होता है। वरीयतः, लॉग फेज में बढ़ती हुई स्वस्थ कोशिकाओं का उपयोग किया जाना चाहिए और माध्यम को जमाने से $24 \mathrm{~h}$ पहले बदल देना चाहिए। साथ ही, कोशिकाओं को कमरे के तापमान से $-80^{\circ} \mathrm{C}$ तक धीरे-धीरे ठंडा किया जाना चाहिए ताकि कोशिकाओं के जमने से पहले पानी कोशिकाओं से बाहर निकल सके। जमी हुई कोशिकाओं को जितनी जल्दी हो सके पिघलाना चाहिए उन्हें रखने वाली शीशी को $37^{\circ} \mathrm{C}$ के पानी के स्नान में मध्यम हिलाते हुए रखकर। यह बर्फ और क्रिस्टल निर्माण को कम करने के लिए है, जो कोशिकाओं को नुकसान पहुंचा सकता है। पिघलाने के बाद, कोशिकाओं को सीधे ऊतक संवर्धन पात्र में स्थानांतरित किया जा सकता है जिसमें आगे की वृद्धि के लिए उपयुक्त माध्यम होता है।

8.6 कोशिका जीवितता निर्धारण

कोशिका जीवितता की माप, अर्थात् जीवित कोशिकाओं का निर्धारण, कोशिका संवर्धन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। कोशिका जीवितता मापों का उपयोग संवर्धित कोशिकाओं की जीवित स्थिति का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है। यह कीटनाशक या कीटनाशक की प्रभावशीलता निर्धारित करने, विषाक्त पदार्थों के कारण हुए नुकसान का मूल्यांकन करने के साथ-साथ किसी औषधि की क्षमता का मूल्यांकन करने आदि के लिए आवश्यक है। आमतौर पर, कोशिका जीवितता परीक्षण या परीक्षा नियमित अंतरालों पर की जानी चाहिए ताकि यह जांचा जा सके कि कोशिकाएं जीवित हैं या मृत हैं। यदि बहुत अधिक मृत कोशिकाएं मौजूद हैं, तो कोशिका निलंबन को बदल देना चाहिए। निम्नलिखित दो प्रकार की जीवितता परीक्षाएं हैं:

(क) वर्णक बहिष्करण जीवितता परीक्षाएं

इस प्रक्रिया में, एक वर्णक या रंजक का उपयोग किया जाता है जो कोशिका में प्रवेश करता है और सामान्यतः केंद्रक में डीएनए के साथ इंटरकैलेट करता है। कोशिका में वर्णक का आंतरिक रूप से प्रवेश कोशिका झिल्ली की अखंडता की हानि को दर्शाता है जिससे कोशिका मृत हो जाती है। दूसरे शब्दों में, जीवित कोशिकाएं वर्णक को बाहर रखती हैं, जबकि मृत कोशिकाएं वर्णक को अंदर आने देती हैं, इसलिए इसे वर्णक-बहिष्करण परीक्षा कहा जाता है। वर्णक बहिष्करण जीवितता परीक्षाओं में उपयोग किए जाने वाले कुछ वर्णक या रंजकों में ट्रिपन ब्लू (चित्र 8.6), प्रोपिडियम आयोडाइड, 7-एमिनोएक्टिनोमाइसिन $\mathrm{D}$ (7-AAD), एक्रिडिन ऑरेंज आदि शामिल हैं।

चित्र 8.6: ट्रिपन ब्लू बहिष्करण परीक्षण द्वारा कोशिका जीवितता

(ख) उपापचयी जीवितता परीक्षाएं

चयापचयी जीवितता परीक्षण कोशिकाओं की एक विशिष्ट जैव-रासायनिक अभिक्रिया को संचालित करने की क्षमता पर आधारित होते हैं, जिसे विभिन्न साधनों जैसे अवशोषण, प्रतिदीप्ति या प्रकाश उत्सर्जन विधियों द्वारा मापा जा सकता है (चित्र 8.7)। परीक्षण की जा सकने वाली अभिक्रियाओं के उदाहरणों में टेट्राज़ोलियम यौगिक का अपचयन शामिल है, जैसे कि MTT परीक्षण जिसे अवशोषण द्वारा मापा जाता है। ये विधियाँ एंजाइम या सब्सट्रेट की कोशिकीय सामग्री और बाद में रंजक के निष्कर्षण के आधार पर कोशिका संख्या का अनुमान लगाने के लिए विकसित की गई हैं। एक पीले रंग का जल-घुलनशील लवण 3-(4,5-डाइमेथिलथियाज़ोल-2-य)2,5-डाइफेनिलटेट्राज़ोलियम ब्रोमाइड [MTT] जीवित कोशिकाओं के माइटोकॉन्ड्रियल डिहाइड्रोजनेज़ एंजाइमों के साथ अभिक्रिया करता है, जो इसे बैंगनी रंग के अघुलनशील फॉर्माज़न क्रिस्टलों में अपचयित करता है, जो अवक्षेपित होकर DMSO में घुल जाते हैं। डिहाइड्रोजनेज़ सामग्री एक विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं के बीच सुसंगत होती है और अपचयित फॉर्माज़न की मात्रा कोशिका संख्या के समानुपाती होती है।

इसके अतिरिक्त, कैल्सीन के एसीटोमेथॉक्सी व्युत्पन्न के अ-प्रतिदीप्य रूप से कोशिका-आंतरिक एस्टरेज़ द्वारा एस्टर हाइड्रोलिसिस के बाद एक प्रतिदीप्य उत्सर्जक घटक में रूपांतरण का भी उपयोग किया जाता है।

चित्र 8.7: चयापचयी जीवितता परीक्षणों का परिणाम। रंग कोशिकाओं की संख्या के समानुपाती होता है

8.7 पशु कोशिका संवर्धन प्रक्रिया का स्केल-अप

विभिन्न स्केल-अप विधियों में सस्पेंशन कल्चर्स के लिए स्पिनर फ्लास्क और एडहिरेंट सेल कल्चर्स के लिए रोलर बोतलें माइक्रोकैरियर बीड्स के साथ शामिल हैं (चित्र 8.8)।

स्पिनर फ्लास्क का उपयोग सस्पेंशन कोशिकाओं के उत्पादन को स्केल-अप करने के लिए किया जाता है। ये एक समतल सतह वाले काँच के फ्लास्क होते हैं जिनमें एक केंद्र में लटकता हुआ टेफ्लन पैडल होता है जो चुंबकीय स्टिरर पर रखने पर माध्यम को हिलाता और घुमाता है। वाणिज्यिक संस्करणों में एक या अधिक साइड आर्म होते हैं जो नमूने लेने और/या डिकैंटेशन के लिए होते हैं। कोशिकाओं को फ्लास्क के तले में बैठने नहीं दिया जाता, और इस प्रकार, कोशिका भीड़ तभी होती है जब कल्चर अत्यधिक उच्च घनत्व तक पहुँचते हैं। माध्यम को हिलाने से गैस विनिमय में सुधार होता है [चित्र 8.8(a)]।

रोलर बोतलों में, कोशिकाएँ माइक्रोकैरियर बीड्स की सम्पूर्ण वक्र सतह से चिपक जाती हैं, जिससे वृद्धि के लिए उपलब्ध स्थान स्पष्ट रूप से बढ़ जाता है। इन ऊतक कल्चर बोतलों का उपयोग विशेष $\mathrm{CO}_{2}$ इनक्यूबेटर्स में किया जा सकता है जिनमें लंबे अक्ष के साथ बोतलों को घुमाने वाले अटैचमेंट होते हैं। बोतल के प्रत्येक पूर्ण घूर्णन के अंत में, सम्पूर्ण कोशिका मोनोलेयर को तेजी से माध्यम के संपर्क में लाया जाता है। माध्यम की मात्रा इतनी होनी चाहिए कि मोनोलेयर पर माध्यम की एक पतली परत बनी रहे [चित्र 8.8(b)]।

विभिन्न व्यासों के माइक्रोबीड्स (\sim 150 \mu \mathrm{m}) (अर्थात् 90-300 (\mu \mathrm{m})) जो डेक्सट्रान, प्लास्टिक, काँच, जिलेटिन या कोलेजन से बने होते हैं, का उपयोग मोनोलेयर कोशिकाओं को उगाने के लिए प्रभावी रूप से किया जा सकता है [चित्र 8.8(c)]। माइक्रोबीड्स पर मोनोलेयर कोशिकाओं की कल्चरिंग से संस्कृति की सतह क्षेत्र और माध्यम के आयतन का अधिकतम अनुपात प्राप्त होता है, लगभग (90,000 \mathrm{~cm}^{2} 1^{-1}) तक, जो बीड्स के आकार और घनत्व पर निर्भर करता है। इसका एक अतिरिक्त लाभ यह है कि कोशिकाओं को निलंबन के रूप में संसाधित किया जा सकता है। माइक्रोवाहक निलंबन संस्कृति की तरह एक पेंडुलम या पैडल का उपयोग करता है ताकि बीड्स को नुकसान पहुँचाए बिना प्रभावी हलचल सुनिश्चित की जा सके। इष्टतम परिस्थितियों में, अनुलग्न कोशिकाओं को उच्च घनत्व तक उगाया जा सकता है इससे पहले कि अत्यधिक विकसित संस्कृतियाँ समस्या बनें।

इस प्रकार के उच्च घनत्व पर बढ़ रही कोशिकाएँ माध्यम को तेजी से समाप्त करने की प्रवृत्ति रखती हैं, जिससे इसे बार-बार भरने की आवश्यकता हो सकती है।

चित्र 8.8: पशु संस्कृति प्रक्रिया के स्केल-अप के लिए उपकरण

8.8 पशु कोशिका संस्कृति के लाभ

पशु कोशिका संस्कृति के लाभ हैं:

• नियंत्रित भौतिक-रासायनिक वातावरण में उगाया जा सकता है।
• समान आनुवंशिक जनसंख्या में वृद्धि कर सकता है।
• जीन जोड़ना आसान बनाता है (जैसे ट्रांसफेक्शन) या प्रोटीन स्तर को नियंत्रित करना (जैसे RNAi)।
• रासायनिक अध्ययन करने के लिए पर्याप्त संख्या में उपलब्ध।
• जैव-औषधीय पदार्थों का आसान उत्पादन। नैतिक स्वीकृति की आवश्यकता नहीं होती।

हालांकि, इसकी कुछ सीमाएँ हैं जो निम्नलिखित हैं:

• यह अत्यधिक संवेदनशील तकनीक है, और यहाँ तक कि छोटे-छोटे बदलाव भी उत्पादकता को कम कर सकते हैं।
• स्केल-अप संभव है लेकिन चुनौतीपूर्ण है।
• यह in vivo फ़ीनोटाइप/जीनोटाइप का समग्र प्रतिनिधित्व नहीं हो सकता है।

8.9 पशु कोशिका संवर्धन के अनुप्रयोग

पशु कोशिका संवर्धन के विविध अनुप्रयोग विभिन्न क्षेत्रों में हैं। कुछ नीचे सूचीबद्ध हैं:

• कोशिकाओं और रोगकारक एजेंटों के बीच पारस्परिक क्रिया तथा उनकी दवाओं के अध्ययन के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में
• वायरस अनुसंधान का अध्ययन करने के लिए एक सुविधाजनक और आर्थिक उपकरण के रूप में
• बड़े पैमाने पर वैक्सीन उत्पादन के लिए एक उपयोगी तकनीक के रूप में
• विभिन्न चिकित्सकीय रूप से महत्वपूर्ण प्रोटीन औषधियों के उत्पादन के लिए एक उत्पादन केंद्र के रूप में। महत्वपूर्ण लोगों को तालिका 8.3 में सूचीबद्ध किया गया है।

तालिका 8.3: औषधीय प्रोटीन और उनका चिकित्सीय उपयोग

प्रोटीन	प्रयुक्त पशु कोशिकाएँ	अनुप्रयोग
फॉलिकल उत्तेजक हार्मोन (FSH)	CHO कोशिकाएँ	बांझपन
मानव वृद्धि हार्मोन (HGH)	CHO कोशिकाएँ	GH की कमी
एरिथ्रोपोएटिन (EPO)	CHO कोशिकाएँ	एनीमिया
कारक VIII	CHO कोशिकाएँ	हीमोफ़िलिया A
कारक IX	CHO कोशिकाएँ	हीमोफ़िलिया B
इंटरल्यूकिन 2 (IL2)	CHO कोशिकाएँ	कैंसर चिकित्सा
टिश्यू प्लाज़्मिनोजन सक्रियक (tPA)	चाइनीज़ हैम्स्टर अंडाशय कोशिकाएँ	स्ट्रोक
मोनोक्लोनल एंटीबॉडीज़ (mAbs)	हाइब्रिडोमा कोशिकाएँ	कैंसर चिकित्सा और ऑटोइम्यून रोग
${ }^{*}$ CHO - चाइनीज़ हैम्स्टर अंडाशय

एरिथ्रोपोएटिन (EPO) एक ग्लाइकोप्रोटीन हार्मोन है जो गुर्दे द्वारा हाइपॉक्सिक (ऑक्सीजन की कमी) या अनॉक्सिया (ऑक्सीजन की पूरी कमी) स्थितियों में स्रावित होता है जो एनीमिया के कारण होती हैं और यह लाल रक्त कोशिकाओं के उत्पादन (एरिथ्रोपोएसिस) और घाव भरने को प्रेरित करता है। EPO अस्थि मज्जा को अधिक लाल कोशिकाएं उत्पन्न करने के लिए उत्तेजित करता है और इस प्रकार रक्त की ऑक्सीजन वहन क्षमता बढ़ाता है। EPO का उपयोग कैंसर रोगियों में कीमोथेरेपी के कारण होने वाले कुछ प्रकार के एनीमिया के इलाज, एड्स के उपचार और यहां तक कि पुरानी गुर्दा विफलता में भी किया जाता है। रिकॉम्बिनेंट मानव EPO ($\mathrm{r}-\mathrm{HuEPO}$) को चाइनीज़ हैम्स्टर ओवरी (CHO) कोशिका लाइनों का उपयोग करके उत्पादित किया गया है। $\mathrm{r}$-HuEPO का उपयोग रक्त आधान की तुलना में फायदेमंद है क्योंकि इसके लिए दाताओं या आधान सुविधाओं की आवश्यकता नहीं होती है, और आधान से जुड़ी बीमारियों का जोखिम कम होता है।

हीमोफिलिया A के लिए फैक्टर VIII, एक सामान्य वंशानुगत आनुवंशिक विकार है जिसमें रक्त के थक्के बनाने के लिए आवश्यक फैक्टर VIII शरीर में उत्पादित नहीं होता है। EPO की तरह, फैक्टर VIII भी एक ग्लाइकोप्रोटीन है और इसे $\mathrm{CHO}$ कोशिकाओं में उत्पादित किया जा सकता है।

हीमोफिलिया B के लिए फैक्टर IX या क्रिसमस रोग एक रक्तस्राव विकार है जो फैक्टर IX की कमी के कारण होता है। CHO कोशिकाओं में उत्पादित रिकॉम्बिनेंट फैक्टर IX का उपयोग हीमोफिलिया B के इलाज के लिए किया जाता है।

टिश्यू प्लाज्मिनोजन एक्टिवेटर (tPA) एक सीरिन प्रोटीज है जो प्लाज्मिनोजन को प्लाज्मिन में बदलने की क्रिया को उत्प्रेरित करता है जो रक्त के थक्कों को घोलने के लिए उत्तरदायी होता है। इसे हृदयाघात या स्ट्रोक वाले कुछ रोगियों में उपयोग के लिए अनुमोदित किया गया है। tPA स्तनधारी कोशिका संवर्धन के माध्यम से बनाया गया पहला औषधि है। tPA का उत्पादन और क्रियाविधि चित्र 8.9 में दिया गया है।

चित्र 8.9: tPA का उत्पादन और क्रियाविधि

मोनोक्लोनल एंटीबॉडी उत्पादन के लिए हाइब्रिडोमा प्रौद्योगिकी

एंटीबॉडीज़ में विशिष्टता होती है कि वे बड़े अणुओं (एंटीजन) के विशेष डोमेन, जिन्हें एपिटोप कहा जाता है, से बंधन कर सकें। सीरम में मौजूद एंटीबॉडीज़ एक विषम समूह होते हैं जो विभिन्न एंटीजनों के विशिष्ट एपिटोपों को पहचानने के बाद B-लिम्फोसाइट्स द्वारा स्रावित होते हैं, इसलिए इन्हें पॉलीक्लोनल एंटीबॉडीज़ कहा जाता है। इसके विपरीत, मोनोक्लोनल एंटीबॉडीज़ (MABs) में एकल विशिष्टता होती है, अर्थात् ये एक एंटीजन पर एक एपिटोप से विशिष्ट रूप से बंधन करते हैं, इसलिए ये विशिष्ट एंटीजनों की पहचान (निदान) में या अन्य अणुओं द्वारा उनके बंधन को अवरुद्ध करने में उपयोगी होते हैं।

चित्र 8.10: मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उत्पादन

MABs उन एंटीजन-सक्रियित B लिम्फोसाइट्स द्वारा उत्पादित किए जाते हैं जिन्हें माइलोमा सेल (कैंसरयुक्त लिम्फोसाइट) के साथ हाइब्रिडाइज़ (फ्यूज़) करके अमर बना दिया गया है। सीज़र मिल्स्टीन और जॉर्ज कोहलर (नोबेल पुरस्कार विजेता) ने पॉलिथिलीन ग्लाइकोल का उपयोग करके एंटीबॉडी स्रावित करने वाली B कोशिकाओं को अमर माइलोमा कोशिकाओं के साथ फ्यूज़ करके हाइब्रिडोमा तकनीक विकसित की। हाइब्रिड कोशिकाएं B कोशिकाओं की एंटीबॉडी उत्पादन करने की क्षमता और माइलोमा कोशिकाओं की अमरता दोनों को बरकरार रखती हैं। हाइब्रिड क्लोन, जब संवर्धन में उगाए जाते हैं, तो एपिटोप-विशिष्ट MAB उत्पन्न करते हैं (चित्र 8.10)। इस तकनीक ने निदान और एंटीबॉडी-आधारित चिकित्सा के क्षेत्र में क्रांति ला दी है। हेपेटाइटिस और एड्स जैसी कई संक्रामक बीमारियों का पता लगाना मोनोक्लोनल एंटीबॉडीज़ की उपलब्धता से सरल हो गया है।

चिकित्सीय MAB - OKT3

म्यूरोमोनैब-सीडी3 (ओकेटी-3) एक माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी है जो सीडी3 रिसेप्टर के विरुद्ध निर्देशित है। यह एक इम्यूनोसप्रेसेंट दवा के रूप में उपयोग की जाती है जो गुर्दे, हृदय और यकृत जैसे प्रत्यारोपित अंगों की तीव्र अस्वीकृति को उलटने के लिए इंट्रावेनस दी जाती है। जब ओकेटी-3 सीडी3 से बंध जाता है, तो टी-सेल रिसेप्टर (टीसीआर) एंडोसाइटोसिस से गुजरता है जिससे एक निष्क्रिय $\mathrm{T}$-सेल बनता है और यह $\mathrm{T}$ कोशिकाओं की कार्य को अवरुद्ध करता है जो तीव्र ग्राफ्ट अस्वीकृति में प्रमुख भूमिका निभाती हैं (चित्र 8.11)। यह बाद की पहचान को रोकता है। $\mathrm{T}$ कोशिकाओं को फिर फैगोसाइटोसिस द्वारा समाप्त कर दिया जाता है। ओकेटी-3 चिकित्सा समाप्त होने के बाद, टी कोशिका कार्य आमतौर पर एक सप्ताह के भीतर सामान्य हो जाता है। ओकेटी-3 पहला मोनोक्लोनल एंटीबॉडी था जिसे क्लिनिक्स में तीव्र अस्वीकृति के उपचार के लिए मंजूरी दी गई थी।

चित्र 8.11: गुर्दा प्रत्यारोपण (केटी) के दौरान ओकेटी-3 का उपयोग

ट्रास्टुज़ुमैब एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी है जिसे उन प्रारंभिक चरण के स्तन कैंसर के उपचार के लिए मंज़ूर किया गया है जो ह्यूमन एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर रिसेप्टर 2-पॉज़िटिव (HER2’) हैं। सामान्य कोशिकाएँ भी HER2 व्यक्त करती हैं, लेकिन कैंसर कोशिकाएँ HER2 ${ }^{+}$ का अत्यधिक अभिव्यक्त करती हैं और साथ ही रिसेप्टर सक्रियण का विक्षोभ भी होता है। ये कोशिका सतह रिसेप्टर संकेत प्राप्त करते हैं जो कोशिकाओं को विभाजित होने के लिए उत्तेजित करते हैं। ट्रास्टुज़ुमैब HER2 रिसेप्टरों से जुड़कर उन्हें विकास संकेत प्राप्त करने से रोकता है। परिणामस्वरूप स्तन कैंसर की वृद्धि बाधित होती है।

सारांश

• पशु कोशिका संवर्धन (animal cell culture) पशु कोशिकाओं की उपयुक्त पोषक माध्यम का उपयोग करके इन विट्रो में रखरखाव और प्रसार है।
• कोशिकाओं के इष्टतम विकास के लिए मूलभूत आवश्यकताएँ तापमान, $\mathrm{pH}$ और उपयुक्त विकास माध्यम हैं।
• पशु कोशिका माध्यम को दो प्रमुख श्रेणियों में वर्गीकृत किया जा सकता है, अर्थात् प्राकृतिक माध्यम और कृत्रिम या संश्लेषित माध्यम।
• प्राकृतिक माध्यम में प्राकृतिक रूप से उपलब्ध जैविक द्रव होते हैं, जैसे प्लाज्मा, ऊतक निष्कर्ष आदि, और यह विस्तृत श्रेणी की पशु कोशिकाओं के संवर्धन के लिए उपयुक्त है।
• कृत्रिम या संश्लेषित माध्यम विभिन्न पोषक तत्वों (कार्बनिक और अकार्बनिक दोनों), विटामिनों, लवणों, $\mathrm{O}{2}$ और $\mathrm{CO}{2}$ गैसों, सीरम, कार्बोहाइड्रेट्स, सह-कारकों आदि से बना होता है, और इसे उद्देश्य के अनुसार संशोधित किया जा सकता है और इसे चार श्रेणियों में विभाजित किया गया है, अर्थात् सीरम युक्त, सीरम रहित, रासायनिक रूप से परिभाषित और प्रोटीन रहित माध्यम।
• कोशिका संवर्धन को प्राथमिक कोशिका संवर्धन और द्वितीयक कोशिका संवर्धन (कोशिका रेखा) के रूप में वर्गीकृत किया जा सकता है।
• प्राथमिक कोशिकाएँ या तो चिपचिपे एक परत (adherent monolayer) के रूप में या सस्पेंशन में विकसित हो सकती हैं।
• द्वितीयक कोशिका रेखाएँ उपसंवर्धन के बाद प्राथमिक कोशिकाओं से प्राप्त की जाती हैं।
• संवर्धन की जीवन अवधि के आधार पर, कोशिका रेखाओं को सीमित और निरंतर कोशिका रेखाओं में वर्गीकृत किया जाता है।
• कोशिका जीवितता माप, अर्थात् जीवित या मृत कोशिकाओं का निर्धारण, कोशिका संवर्धन में अत्यंत महत्वपूर्ण है और इसे वर्णक बहिष्करण या जीवितता परीक्षणों और चयापचय जीवितता परीक्षणों के माध्यम से किया जाता है।
• कोशिका संवर्धन प्रौद्योगिकी का उपयोग विभिन्न क्षेत्रों में होता है, जैसे आण्विक आनुवंशिकी, प्रतिरक्षीय विश्लेषण, जीन चिकित्सा, जैव अभियांत्रिकी, फार्मास्युटिकल उद्योग आदि।
• पशु कोशिका संवर्धन औषधि के अनुसंधान और विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है और यह कैंसर, आनुवंशिक विकार आदि जैसी विभिन्न बीमारियों से पीड़ित रोगियों के स्वास्थ्य और जीवन की गुणवत्ता में सुधार करने में भी मदद करता है।

अभ्यास

1. पशु कोशिका संवर्धन क्या है?

2. पशु कोशिका संवर्धन माध्यम और उनके प्रकारों का वर्णन कीजिए।

3. संवर्धन माध्यम में सीरम के लाभ और हानियाँ लिखिए।

4. रासायनिक रूप से संश्लेषित कोई दो माध्यमों का वर्णन कीजिए।

5. प्राथमिक कोशिका संवर्धन क्या है? यह भी चर्चा कीजिए कि यह कैसे विकसित किया जाता है।

6. उपसंवर्धन या कोशिका का पैसेजिंग क्या है?

7. परिमित और निरंतर कोशिका रेखाओं में अंतर कीजिए।

8. कोशिका जीवितता मापन कैसे की जाती है?

9. कोशिका संवर्धन के अनुप्रयोगों का विस्तृत विवरण लिखिए।

10. पशु कोशिका संवर्धन माध्यम का उदाहरण है:

(a) DMEM

(b) MS माध्यम

(c) LB माध्यम

(d) उपर्युक्त सभी

11. उस संवर्धन के प्रकार का नाम बताइए जो किसी जीव के ऊतक से सीधे संवर्धन माध्यम में अंतःक्षेपण करके तैयार किया जाता है।

(a) प्राथमिक कोशिका संवर्धन

(b) द्वितीयक कोशिका संवर्धन

(c) कोशिका रेखाएँ

(d) रूपांतरित कोशिका संवर्धन

12. पशु कोशिका संवर्धन माध्यम में सोडियम बाइकार्बोनेट इसलिए मिलाया जाता है कि

(a) कोशिकाओं को प्लास्टिक से चिपकाए रखे

(b) $\mathrm{CO}_{2}$ के पशु कोशिकाओं में आने को बढ़ावा दे

(c) $\mathrm{CO}_{2}$ मौजूद होने पर सही $\mathrm{pH}$ बनाए रखे

(d) आयरन को घुलनशील बनाए रखे

13. निम्नलिखित में से कौन पशु कोशिका संवर्धन के वृद्धि माध्यम में मौजूद नहीं होता?

(a) अकार्बनिक लवण

(b) बाइकार्बोनेट

(c) कार्बन स्रोत

(d) स्टार्च

14. कोशिकाओं का पृथक्करण निम्नलिखित द्वारा किया जा सकता है:

(a) भौतिक विघटन

(b) एंजाइमेटिक पाचन

(c) कैलेटिंग एजेंटों से उपचार

(d) उपर्युक्त सभी

15. वह दृष्टिकोण जिसमें जीनों को जानवरों में स्थानांतरित किया जाता है ताकि दूध, रक्त आदि में इन जीनों द्वारा एन्कोड किए गए प्रोटीनों का बड़े पैमाने पर उत्पादन प्राप्त किया जा सके, को कहा जाता है

(a) इन सिटू कल्चर

(b) आण्विक फार्मिंग

(c) जीन थेरेपी

(d) हाइब्रिडोमा प्रौद्योगिकी

16. निम्नलिखित में से कौन-सा प्रोटीन-रहित पशु कोशिका संवर्धन माध्यम है?

(a) RPMI-1640 माध्यम

(b) MS माध्यम

(c) LB माध्यम

(d) उपर्युक्त में से कोई नहीं

17. MTT परीक्षण का उपयोग किसके लिए किया जाता है?

(a) कोशिका जीवितता परीक्षण

(b) संवर्धन माध्यम के pH में परिवर्तन की निगरानी

(c) रूपांतरण स्क्रीनिंग

(d) सब्सट्रेट से कोशिका विघटन

18. पशु कोशिका संवर्धन में पशु कोशिकाओं का पैसेजिंग

(a) कोशिकाओं की उप-संवर्धन है

(b) कोशिकाओं का पृथक्करण है

(c) कोशिकाओं को संवर्धन नलिका से पेट्री डिश में स्थानांतरित करना है

(d) कोशिकाओं की गिनती है

19. निम्नलिखित में से कौन-सा सीरम का प्रमुख कार्य नहीं है?

(a) कोशिका आसंजन को बढ़ाना

(b) कोशिका वृद्धि को उत्तेजित करना

(c) कंद और बल्ब निर्माण को बढ़ावा देना

(d) परिवहन प्रोटीन प्रदान करना

20. अभिकथन: सीरम संवर्धन माध्यम का सबसे महत्वपूर्ण घटक है।

कारण: सीरम पोषक तत्वों का एक अच्छा स्रोत है और यह कोशिका प्रसार तथा कोशिका-मैट्रिक्स आसंजन में भी सहायता करता है।

(a) दोनों अभिकथन और कारण सत्य हैं और कारण अभिकथन का सही स्पष्टीकरण है।

(b) दोनों अभिकथन और कारण सत्य हैं लेकिन कारण अभिकथन का सही स्पष्टीकरण नहीं है।

(c) अभिकथन सत्य है लेकिन कारण असत्य है।

(d) दोनों अभिकथन और कारण असत्य हैं।

21. दावा: सामान्य कोशिकाओं की प्राथमिक संवर्धन से प्राप्त कोशिका रेखाएँ परिमित कोशिका रेखाएँ होती हैं।

कारण: परिमित कोशिका रेखा की कुछ कोशिकाएँ रूपांतरण से गुजरती हैं और अनिश्चित काल तक विभाजित होने की क्षमता को बनाए रखती हैं।

(a) दावा और कारण दोनों सत्य हैं और कारण दावे का सही स्पष्टीकरण है।

(b) दावा और कारण दोनों सत्य हैं लेकिन कारण दावे का सही स्पष्टीकरण नहीं है।

(c) दावा सत्य है लेकिन कारण असत्य है।

(d) दावा और कारण दोनों असत्य हैं।